低氧预处理人脐带间充质干细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

摘要

目的：　　本课题在体外收集脐带，分离、培养、扩增、鉴定人脐带间充质干细胞( humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)，将hUC-MSCs进行不同浓度低氧预处理，观察抗凋亡能力和分泌细胞因子能力的变化。选取中华小型猪建立急性心肌梗死模型，将低氧预处理hUC-MSCs和未处理hUC-MSCs经心外膜移植到心肌梗死组织周围，比较两者在心肌组织修复中作用有无差别，并进一步探讨可能存在的机制。　　方法：　　无菌条件下采集足月剖腹产胎儿脐带，经体外分离、培养、扩增hUC-MSCs至第六代，进行鉴定。按照预处理氧浓度不同分为1% O2组，3%O2组，5%O2组，10% O2组和对照组(21% O2组)，各组hUC-MSCs在设定氧浓度条件下预处理24小时。通过实时定量PCR、ELISA、Annexin V-FITC/PI等方法比较各组细胞抗凋亡能力和细胞因子分泌能力不同，选取结果最佳的组进行动物实验。选取中华小型猪，全麻下经正中切口入胸，结扎冠状动脉左前降支远端1/3处，制作急性心梗模型。将实验动物随机分3组（6只／组）：对照组( Control)在心梗局部注射生理盐水，正常培养hUC-MSCs组(Nor)注射未处理hUC-MSCs，低氧预处理组(Hyp)注射低氧预处理hUC-MSCs。细胞注射量为2.5 x 107/只，分10到15个点注射。术后即刻、术后6周行超声心动图，静息核素心肌灌注显像检查。6周后人道处死动物，采集心脏标本，用Masson三染色、免疫荧光染色和TUNEL染色观察移植干细胞在体内定植、生存、血管新生及细胞凋亡情况。　　结果：　　(1)hUC-MSCs表面分子表型CD73、CD90、CD105阳性表达，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR阴性表达。实时定量PCR示促凋亡基因Bax在1%O2组、3%O2组表达量均显著低于对照组（21%O2组）和10%O2组(p＜0.01)，其余各组间比较无统计学差异。抗凋亡基因Bcl-2在所有低氧预处理组表达量均显著高于对照组(p＜0.01)；在1%O2组表达量显著低于3%O2组(p＜0.01)，在1%O2组表达量低于5%O2组，有统计学意义(p＜0.05)，其余各组间比较无统计学差异。凋亡诱导实验后，AnnexinV/PI检测示所有低氧预处理组hUC-MSCs与阳性对照组（21%O2组）相比，早期、晚期及总凋亡数量均显著减少(p＜0.01)。1%O2组和3%O2组hUC-MSCs早期凋亡低于l0%O2组，有统计学意义(p＜0.05)，其余各组之间无统计学差异。　　(2)实时定量PCR示HGF基因在1%O2组、3%O2组和5%O2组表达量均显著高于对照组（21%O2组）(p＜0.01)；在1%O2组和3%O2组表达量显著高于10%O2组(p＜0.01); VEGF在3%O2组表达量较高，但与对照组比较无统计学差异；KGF在3%O2组和5%O2组表达量均显著高于对照组、10%O2组以及1%O2组(p＜0.01); NGF在3%O2组和5%O2组表达量均显著高于对照组(p＜0.0l)，在3%O2组表达量高于10%O2组和1%O2组，有统计学差异(P＜0.05)，在5%O2组表达量著高于10%O2组(p＜0.01)。ELISA检测示：HGF分泌量在1%O2、3%O2组均显著高于对照组和10%O2组(p＜0.01)。VEGF分泌量在3%O2组高于对照组和10%O2组，有统计学意义(p＜0.05)。KGF分泌量在3%O2组和5%O2组均显著高于1%O2组和对照组(p＜0.01)。NGF分泌量在3%O2组和5%O2组均高于对照组，有统计学意义(p＜0.05)。　　(3)干细胞移植6周后，超声心动图示低氧预处理组LVEDV低于对照组P＜0.05，各组术后6周与术后即刻LVEF的差值比较，低氧预处理组高于对照组，P＜0.05。术后6周，低氧预处理组和正常氧干细胞移植组ΔWT%均显著高于对照组(P＜0.0l)，低氧预处理组高于正常氧干细胞移植组，有统计学意义(P＜0.05)。静息放射核素显像示灌注质量缺损百分率(massdefect percent，MDP)的差值即AMDP比较，两干细胞治疗组显著低于对照组(P＜0.01)。各组术后6周与术后即刻LVEF的差值比较，低氧预处理组高于对照组，有统计学意义(P＜0.05)。Masson三染色示低氧预处理组纤维组织面积小于正常氧细胞组，后者小于对照组，有统计学意义(Hyp:37.14±1.78%,Nor: 41.41±0.58%，Control: 47.20±3.07%,P＜0.05)。低氧预处理组与对照组相比纤维组织面积显著减少(P＜0.01)。　　(4)免疫荧光测定显示：在低氧预处理组存活的hUC-MSCs即人p2微球蛋白阳性细胞（Hyp: 39.0±7.6cells/hpf，Nor: 18. 7±5.7 cells/hpf，）明显多于正常氧培养组，有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL染色法示两干细胞治疗组凋亡细胞均显著少于对照组（Hyp：10.0±2.6cells/hpf，Nor：49.0±6.6cells/hpf，Control: 87.0±9.Ocells/hpf，P＜0.01），低氧预处理组凋亡细胞显著少于正常氧培养组(P＜0.01)。低氧预处理组Isolactin B4阳性累计光密度值(integrated optical density,IOD)显著多于正常氧培养组和对照组（Hyp: 517856.7±43670.5pixels/hpf,Nor: 238294.7±66840.0 pixels/hpf,Control: 137114.0±15168.7pixels/hpf，P＜0.01），正常氧培养组Isolactin B4阳性IOD多于对照组，有统计学意义(P＜0.05)。　　结论：　　(1)3%低氧预处理能提高hUC-MSCs抗凋亡能力和分泌细胞因子的能力。　　(2)移植低氧预处理hUC-MSCs能在一定程度上改善心肌梗死后心脏功能的恢复。　　(3)低氧预处理hUC-MSCs在移植局部有更强的生存能力，能减少心梗局部瘢痕面积，减少纤维化。能通过旁分泌作用促进血管新生，减少心肌细胞凋亡。

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