Strobilurin类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的作用机制、检测方法研究及其在柑橘中的残留规律

摘要

柑橘采后经常因真菌感染而造成较大的经济损失,利用杀菌剂控制真菌病害是一种有效的途径。醚菌酯和肟菌酯属新型Strobilurin类杀菌剂,具有安全、广谱、高效的特点,可有效防治柑橘采后的真菌病害,但相关作用机制及其在柑橘中的残留检测研究报道较少。本论文针对醚菌酯和肟菌酯应用的生产实践需求,开展醚菌酯和肟菌酯的作用机制、残留检测方法及其在柑橘中降解规律研究,以促进柑橘及其制品的食用安全。主要研究结果如下:
　　1.醚菌酯和肟菌酯对三种病原真菌的作用效果及机制选用柑橘青霉、绿霉、炭疽菌进行体外培养,当培养基中分别含有两种杀菌剂时,醚菌酯和肟菌酯对三种病原真菌的半最大效应浓度(EC50)分别为13.22,66.92,273.74μg/mL和0.18,0.32,1.37μg/mL。将三种真菌于EC50浓度水平的含醚菌酯和肟菌酯培养基中培养,菌丝蛋白含量为检测目标,青霉菌和绿霉菌可溶性蛋白含量分别从3h和1h后降低并持续至24h,炭疽菌可溶性蛋白含量从开始下降到再次上升只维持了3h,此后则逐渐升高;当培养基中同时含有旁路氧化酶抑制剂SHAM时,醚菌酯和肟菌酯抑制三种病原真菌的EC50浓度水平明显下降,各菌丝体可溶性蛋白总水平也明显降低。结果表明,醚菌酯和肟菌酯能较好地抑制三种病原真菌生长,SHAM与两种杀菌剂均有协同作用效果。
　　采用差速离心法获得真菌线粒体,分别研究0.2-200μg/mL的醚菌酯和肟菌酯对真菌线粒体内膜上四种酶复合体活性的影响。结果表明,两者对复合体的活性影响趋同,四种复合体活性的抑制率与药剂浓度成正相关,但各处理浓度下的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ受抑制程度均不如复合体Ⅲ;相同浓度处理下,醚菌酯和肟菌酯对青霉菌和绿霉菌中的复合体Ⅲ抑制程度较炭疽菌的大。醚菌酯和肟菌酯可通过影响线粒体呼吸链酶复合体活性而抑制真菌的生长。
　　2.醚菌酯和肟菌酯QuEchERS-HPLC同步检测方法的建立以AOAC认可的QuEchERS法为基础,样品采用含1％乙酸的乙腈溶液,通过优化吸附剂确定采用PSA:C18(4:1/m:m)作为最佳前处理条件。同步检测采用210nm的波长,甲醇:水(80:20)为流动相洗脱,醚菌酯和肟菌酯的保留时间分别为9.3 min和12.3 min。当加标浓度为1.0,0.5,0.05 mg/kg时,橘肉和橘皮中醚菌酯的平均回收率约为83.93%~95.50%和80.08%~93.77%,相对标准偏差 RSD%分别为1.55%~4.50%和1.80%~4.24%;肟菌酯的平均回收率约为80.84%~93.47%和80.00%~91.00%,相对标准偏差RSD%分别为3.00%~4.20%,1.40%~5.20%。醚菌酯和肟菌酯的最低检出浓度分别为0.005和0.008 mg/kg,符合农残分析的国际标准要求。
　　3.醚菌酯和肟菌酯ELISA检测方法的建立1)将含醚菌酯和肟菌酯共有活性基团的(E)-2(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯(OEBr)与巯基丙酸反应获得羧基,以其为连接臂,采用活化酯法、混合酸酐法分别制备免疫原和包被原,反应产物分别利用紫外吸收扫描与结合比的测定、红外、质谱、核磁、SDS-PAGE方法进行鉴定表明,免疫原和包被原合成成功,其中免疫原的结合比为12.8:1,达到动物免疫的要求。
　　2)免疫原与弗氏佐剂充分乳化制备疫苗,采用多点皮下、腿部肌肉免疫3只新西兰大白兔,为期3个月。当3只兔子的抗血清效价分别为64000,32000,32000且不再上升时,采用效价最高的抗血清进行下一步实验。
　　3)以包被原Hapten-OVA和获得的最高效价抗体(Ab)建立 IC-ELISA法。该方法对通用半抗原的IC50为9.5μg/mL,IC10为0.005μg/mL;抗体对醚菌酯和肟菌酯有较好的特异性和灵敏性,IC50分别为15.3,19.6μg/mL,IC10分别为0.0074,0.011μg/mL;但对唑菌铵酯的交叉反应率小于0.1%。结果表明该方法可作为醚菌酯和肟菌酯的酶联免疫分析使用。
　　4)采用建立的IC-ELISA检测柑橘样品中醚菌酯和肟菌酯,检测结果表明当加标浓度为100,10,1μg/mL时,醚菌酯回收率分别为104.35%,95.57%,82.73%,RSD%分别为11.1%,10.8%,8.8%;肟菌酯回收率分别为92.43%,91.75%,91.10%,RSD%分别为7.4%,10.2%,10.9%,此方法符合杀菌剂痕量分析的要求。
　　4.柑橘中醚菌酯和肟菌酯的残留规律研究用建立的QuEchERS-HPLC同步检测方法,探讨橘皮和橘肉中的醚菌酯和肟菌酯的降解规律。结果表明,储藏12天后97%的杀菌剂已被降解,食用部分的含量低于国际上做出的最大残留限量(0.5-2ppm)。醚菌酯和肟菌酯在橘肉中的残留水平始终低于橘皮残留量,在橘皮上的残留规律复合一级动力学方程,其半衰期分别为2.63–2.66天和3.12–3.15天。

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1绪论

1.1我国柑橘生产和储藏现状

1.2新型Strobilurin类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的研究进展

1.3 醚菌酯和肟菌酯国际残留限量标准

1.4 柑橘中醚菌酯和肟菌酯残留的前处理技术

1.5 柑橘中农残检测技术研究进展

1.6 立题的目的和意义

2 醚菌酯和肟菌酯对三种柑橘真菌的作用效果及机制

2.1 主要实验材料

2.2 主要实验试剂

2.3 主要培养基

2.4 仪器设备

2.5 实验方法

2.6 结果与分析

3同步检测柑橘中醚菌酯和肟菌酯的QuEchERS-HPLC方法建立

3.1 实验材料与试剂

3.2 实验仪器

3.3 醚菌酯和肟菌酯的检测方法

3.4 方法准确性验证

3.5 结果与分析

4 ELISA检测醚菌酯和肟菌酯残留方法的建立

4.1 人工抗原的合成与鉴定

4.2多克隆抗体的制备

4.3抗血清效价的测定

4.4间接竞争ELISA检测方法的建立

4.5 样品检测

5 醚菌酯和肟菌酯在柑橘中的残留规律

5.1 实验试剂与仪器

5.2室内施药实验

5.3 残留规律测定

5.4 结果与分析

6 结论与展望

参考文献

作者简历