转基因抗虫棉花不同发育期叶片蛋白质组的比较分析

摘要

棉花在国民经济中具有重要地位,是我国仅次于粮食作物的第二大农作物,其中转基因抗虫棉在国内的种植面积已占棉花总种植面积的70％以上,并有持续增长的趋势。棉花是纤维研究的模式植物,但与拟南芥、水稻等模式植物相比,其在蛋白质组学、基因组学、生理学和遗传学等方面的研究较薄弱。棉花蛋白质组学研究起步较晚,双向电泳图谱库和蛋白质组数据库均有待完善;且目前棉花蛋白质组学研究主要集中在纤维发育机制、胁迫反应等方面,有关棉花发育期的蛋白质组学研究在国内外鲜有报道。
　　本研究以转cry1Ab基因抗虫棉(07-19和08-6)及ZHNO7-222(转基因抗虫棉07-19的亲本)为材料,利用双向电泳、生物质谱和生物信息学对棉花苗期和花铃期叶片蛋白质组变化进行了比较分析,探讨苗期和花铃期棉花叶片蛋白质组的表达差异。研究结果表明,在苗期和花铃期间筛选获得3个品种共有的差异表达蛋白点26个,3个品种在花铃期表达上调和下调的差异蛋白点数相同,均为9个(34.6%)和17个(65.4%)。26个共有差异蛋白点经MALDI-TOF-MS/MS成功鉴定了17个,归类为15种蛋白质,这15种蛋白分别是线粒体甘氨酸脱羧酶复合体类似P蛋白、叶绿体叶绿素A-B结合蛋白、捕光色素a结合蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基、抗坏血酸过氧化物酶、转录因子APFI类似蛋白、肽基脯氨酰基顺反异构酶、异黄酮还原酶类似蛋白、Clp ATPase、依赖于NAD的表异构酶/脱水酶、ATP合成酶CF1ε亚基、异柠檬酸脱氢酶、尿嘧啶转磷酸核糖激酶和50S核糖体蛋白L21。上述蛋白参与TCA循环、光合代谢、逆境胁迫、APT合成、蛋白质合成、碳固定等。推测出现的蛋白质组变化可能与棉花生长发育相关。
　　本研究比较分析了3个棉花品种苗期和花铃期的叶片蛋白质组差异,以揭示转基因和杂交过程引起的品种间叶片蛋白质组的表达差异。质谱成功鉴定了3个品种(07-19、08-6和ZHNO7-222)苗期的差异表达蛋白点47个,归为25种蛋白质,这些差异表达蛋白参与光合代谢、三羧酸循环、糖酵解、细胞发育、细胞骨架、信号转导、生长发育、胁迫防御等。质谱成功鉴定三个品种花铃期的差异表达蛋白点34个,归为22种蛋白质,这些差异表达蛋白参与光合代谢、核苷酸代谢、ATP合成、三羧酸循环、细胞分裂/分化、信号转导、生长发育、抗逆等方面。推测出现的苗期和花铃期不同品种间叶片蛋白质组变化可能与转基因过程和杂交过程中基因重组有关。
　　为进一步验证筛选获得的差异蛋白表达情况,本研究从质谱鉴定成功的差异蛋白中选择抗坏血酸过氧化物酶(APX)、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(rbcL)作为研究对象,克隆获得了这三个蛋白相关基因编码区域的部分片段:APX基因扩增片段大小为581bp,ICDH基因扩增片段大小为1055bp,rbcL基因扩增片段大小为1121bp。经NCBI数据库Blast比对,三个基因(APX、ICDH和rbcL)片段与陆地棉中相应基因的匹配率分别为97.9%、99.1%、99.3%。对三个基因表达量进行实时荧光定量分析,结果表明:APX基因和ICDH基因在花铃期表达下调,rbcL基因在花铃期表达上调;各基因表达变化趋势与相应蛋白表达变化趋势一致。

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表清单

1 绪论

1.1 棉花及其转基因育种简况

1.2 植物蛋白质组学

1.3 基因定量方法简介

1.4 本论文研究的目的和意义

2 不同发育期棉花叶片蛋白质组学分析

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 不同棉花品种间叶片蛋白质组学分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 发育期差异蛋白点基因序列克隆及表达验证分析

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 总结、创新与展望

5.1 全文总结

5.2 创新点

5.3 课题展望

参考文献

作者简历