谷氨酰基转移酶的制备及其作为参考物质特性的研究

摘要

随着人们对酶标准化工作和计量学溯源体系的深入认识，参考方法、参考物质和参考实验室网络的结合成为国内外普遍认可的实现酶活性测定标准化的重要途径，而使用公认的酶校准物作为载体，将测定结果的数值在参考方法和常规方法间进行准确性的传递是目前酶标准化工作的关键环节之一。虽然我国的室间及室内质量控制工作在临床实验室中已广泛开展，酶校准品的应用价值也更受关注，但目前我国使用的酶校准品和质控品基本依赖进口，价格昂贵，在不同的测定仪器和试剂上应用时受到互通性限制。所以，对于我国的酶标准化工作来说，实现参考物质的国产化是目前面临的重要课题。 本文谷氨酰基转移酶(GGT，EC2.3.0.2)是从猪肾皮质中提取的。经过匀浆，DOC溶解和硫酸铵分级沉淀粗提取，木瓜蛋白酶的消化酶解，再经过脱盐、DEAE阴离子交换层析和Superdex 75 pg凝胶层析，得出高比活高纯度的GGT样品。该样品应为猪肾皮质全分子的水溶性轻链，分子量为21kD，纯化后的比活为124U/mg。经SDS-PAGE电泳检验，为单一条带，证明样品高纯度。 初步建立了GGT参考测定方法，并对纯化后蛋白的保存基质进行了稳定性和互通性研究。初步的观察结果表明，120天内，4℃和-20℃时GGT在CRM基质和自制基质中保持稳定，37℃下活性浓度损失均小于5﹪；在人血清基质中4℃保存的样品40天内活性浓度下降15.2﹪，37℃保存的样品在15天内活性下降1.9﹪，40天内下降39﹪。在两种常规方法和参考方法的比较中，仅CRM基质的高值样本偏于95﹪可信区间。说明提纯的GGT具有良好的互换性，该样品具有良好的应用前景，特别是自制基质和CRM基质的样品溶液，可作为候选校准品应用于临床检测。

目录

文摘

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致谢

1 引言

1.1谷氨酰基转移酶的蛋白结构与生物学特性

1.1.1谷氨酰基转移酶的蛋白结构

1.1.2 GGT的分子量和等电点

1.1.3催化特性

1.1.4组织学分布

1.2 GGT的临床诊断意义和测定方法

1.2.1 GGT的临床诊断意义

1.2.2 GGT活性的测定方法

1.3 血清酶活性测定的量值溯源

1.3.1国际酶标准化进展

1.3.2国内标准化的进展

1.3.3参考系统

1.3.4 临床酶学的溯源性

2 谷氨酰基转移酶从猪肾皮质中的纯化

2.1材料

2.1.1猪肾来源

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.2方法

2.2.1缓冲溶液的配制

2.2.2 GGT预处理：

2.2.3 GGT初提取：

2.2.4制备型液相色谱的精细纯化

2.2.5 SDS-PAGE电泳

2.3结果

2.3.1蛋白质纯化步骤

2.3.2 Sephadex G-25脱盐层析

2.3.3 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析

2.3.4凝胶Superdex 75 prep grade层析

2.3.5 SDS-PAGE电泳

2.3.6其他酶活性的检测

2.4结论

3 谷氨酰基转移酶(GGT)37℃参考测定方法的初步建立

3.1材料

3.1.1仪器

3.1.2试剂

3.2方法

3.2.1试剂的准备

3.2.2仪器的校准

3.2.3参考方法的测定

3.2.4 3.2.4空白对照

3.2.5测定人血清样品

3.2.6测定Roche c.fas校准品

3.3结果

3.3.1低值血清标本测定结果

3.3.2中值血清标本测定结果

3.3.3高值血清标本测定结果

3.3.4测定Roche c.fas校准品

3.4结论

4 从猪肾中提取GGT在不同基质中的稳定性与互通性研究

4.1材料

4.1.1仪器

4.1.2试剂

4.2实验方法

4.2.1纯化后GGT在不同基质里的稳定性

4.2.2不同基质中的纯化后的GGT与人血清不同方法间的互通性

4.3结果

4.3.1纯化后GGT在不同基质里的稳定性

4.3.2不同基质中的从猪肾提取的GGT互通性研究

4.4结论

5 结论

5.1 从猪肾皮质中提取GGT

5.2参考方法的建立

5.3从猪肾提纯GGT的稳定性与互通性初步研究

参考文献

附录

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