n-3多不饱和脂肪酸在哮喘小鼠白三烯代谢及气道炎症中的作用

摘要

目的：(1)观察哮喘小鼠白三烯B<,4>(LTB<,4>)、5脂氧合酶(5-LO)及其mRNA表达情况.(2)研究饮食中补充不同剂量的n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)对哮喘小鼠LTB<,4>、5-LO的影响及其可能机制.(3)观察过氧化物酶体增殖活化受体-γ(PPAR-γ)在哮喘气道中的表达及n-3PUFA对它的影响.(4)探讨n-3PUFA对哮喘小鼠气道炎症细胞计数、IL-4的影响及其机制. 方法：建立小鼠卵清白蛋白(OVA)致敏和激发的哮喘模型.50只SPF级雄性BALB/c小鼠(3-5周)随机分为五组,每组10只:A组(正常对照组),B组(哮喘模型组),C组(低剂量鱼油干预组),D组(中剂量鱼油干预组),E组(高剂量鱼油干预组).正常组用生理盐水,模型组及各干预组用OVA/A1(OH)<,3>混合凝胶于第8、21天腹腔注射(i.p)致敏,第32天开始激发,每日一次,每次30分钟,连续7天.每日上午8时30分C、D、E分别灌胃给予鱼油0.12 g/kg、0.24 g/kg、0.48g/kg,其余两组以生理盐水代替.末次激发后24小时内处死小鼠用固相夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清及对支气管肺泡灌洗液(BALF)中LTB<,4>、IL-4水平,行BALF细胞总数计数,BALF沉渣涂片作细胞分类计数,肺组织作病理检测观察肺组织结构,免疫组化、RT-PCR法检测肺组织中5-LO及PPAR-γ的表达情况等. 结果：1.细胞计数及分类计数:B组BALF细胞总数[(100.39±25.62)×10<'7>/L]、嗜酸细胞百分比[(9.42±3.58)﹪]均显著高于A组[分别为(21.51±6.24)×10<'7>/L、(0.16±0.07)﹪](均P<0.01);C组[分别为(89.50±23.73)×10<'7>/L、(5.89±2.06)﹪]、D组[分别为(59.13±16.99)×10<'7>/L、(3.31±1.09)﹪]、E组[分别为(48.89±11.62)×10<'7>/L、(1.92±0.36)﹪],均低于B组,但仍高于A组(P<0.05或P<0.01). 2.光镜下肺组织病理改变:小鼠肺组织切片HE染色B组可见支气管和血管周围炎性细胞浸润,以淋巴细胞、EOS和中性粒细胞为主,支气管上皮多处断裂,并有基底膜增厚和平滑肌肥大等表现;C组、D组、E组上述改变程度不一,均LLB组轻,其中以E组最为轻微.A组支气管和血管周围未见炎性细胞浸润,细支气管未出现增殖情况. 3.电镜观察肺组织超微结构:电镜下A组(正常对照组)显示正常的肺泡隔和肺泡II型上皮细胞,支气管纤毛上皮排列整齐;B组肺泡隔明显增厚,炎症细胞增多,基底膜增厚,肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀,出现板层小体及线粒体空泡现象,支气管上皮细胞纤毛排列稀疏;C组、D组、E组上述改变程度不一,均比B组轻. 4.BALF中LTB<,4>浓度:B组BALF中LTB<,4>的浓度[(143.001±63.355)pg/ml]显著高于A组[(41.437±14.422)pg/ml](P<0.01);C组[(67.663±36.885)pg/ml]、D组[(46.416±15.785)pg/ml]、E组[(53.258±14.988)pg/ml]与B组比较明显降低(P<0.01或P<0.05),其中D组、E组与A组比较无显著性差异(P>0.05). 5.血清、BALF中IL-4浓度: B组血清IL-4浓度[(14.82±4.79)pg/ml]及BALF中IL-4浓度[(144.08±47.35)pg/ml]均较对照组高[分别为(5.60±1.80)Pg/ml、(30.52±9.38)pg/ml](P<0.01):C组分别为[(11.32±4.05)pg/ml、(113.69±46.01)pg/ml]、D组分别为[(10.39±3.45)pg/ml、(80.55±23.74)pg/ml]和E组分别为[(9.29±3.37)pg/ml、(79.53+20.71)pg/ml]较A组均有所升高(P<0.05或P<0.01),其中D组、E组低于哮喘组(P<0.05). 6.免疫组化检N5-LO表达结果:B组小鼠肺组织5-LO表达(0.201±0.019)明显高于对照组(0.084±0.009)(P(O.01):C组(0.183±0.022)、D组(0.176±0.017)和E组(0.103±0.016)均有所升高,但低于哮喘组(P<0.05或P<0.01). 7.RT-PCR检测5-LO mRNA表达的结果: 哮喘组小鼠5-LO mRNA的表达(0.605±0.057)明显高于对照组(0.236±0.019) (P<0.01);C组(0.408±0.049)、D组(0.328±0.024)、E组(0.244±0.020)呈不同程度的升高,但低于哮喘组(P<0.05或P(0.01). 8.免疫组化检测tIPPAR-γ表达结果:哮喘组小鼠肺组织PPAR-γ表达(1.898±0.197)明显低于对照组(3.104±0.294)(P<0.01);C组(3.677±0.412)、D组(4.045±0.479)和E组(4.826±0.433)均较A组、B组明显升高(P<0.05或P(0.01),各干预组问没有显著性差异(P>0.05). 9.相关分析:小鼠肺组织中5-LO mRNA含量与BALF中LTB<,4>浓度、BALF中IL-4浓度、BALF细胞总数成正相关;小鼠BALF中LTB<,4>浓度与BALF中IL-4浓度、BALF细胞总数成正相关;小鼠肺组织中PPAR-γ的表达与BALF细胞总数、BALF中IL-4浓度、小鼠肺组织中5-LO mRNA含量、BALF中LTB<,4>浓度呈负相关. 结论：1.哮喘小鼠肺组织5-LO及其mRNA表达增多,其与气道炎症因子、炎症细胞计数呈正相关. 2.哮喘小鼠PPAR-γ表达较对照组下降,各干预组肺组织WAR-γ表达明显增加,并与肺组织5-LO的表达、炎症细胞计数、IL-4浓度呈负相关. 3.小鼠补充n-3PUFA能够降低LTB<,4>浓度,下调IL-4水平,减少EOS浸润减轻气道炎症. 4.小鼠补充n-3PUFA后下调5-LO基因的表达是降低8ALF中自三烯浓度的机制之一,此过程可能与激活PPAR-γ有关.

目录

缩略词表*

前 言

材料与方法

1.实验动物

2.主要仪器与试剂

3.主要试剂的配制

4.动物模型的建立、分组与饲养

5.血、BALF、肺组织标本的留取

6.BALF中细胞计数和分类计数

7.光镜标本制作与观察

8.电镜标本制作与观察

9.ELISA法测血清、BALF中LTB4、IL-4浓度

10.免疫组化SP法测肺组织中5-L0、PPAR-γ的表达

11.RT-PCR法测肺组织5-L0的表达

12.统计学处理

结 果

1.各组小鼠症状

2.BALF中细胞计数和BALF沉渣涂片分类计数

3.各组小鼠肺组织病理改变

4.各组小鼠支气管及肺小动脉超微结构的改变

5.各组小鼠BALF中LTB4浓度的变化

6.各组小鼠血清、BALF中IL-4浓度的变化

7.各组小鼠肺组织中5-L0的变化

8.各组小鼠肺组织5-L0 mRNA的变化

9.各组小鼠肺组织中PPAR-γ的变化

10.相关性分析

11.附图

分析与讨论

1.卵蛋白哮喘小鼠模型建立的评价

2.5-L0及LTs与哮喘气道炎症

3.过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)在哮喘气道炎症中的作用

4.PUFA在哮喘中的作用及其对白三烯影响的可能机制

结 论及今后研究方向

参考文献

个人信息

致 谢

综述 n-3多不饱和脂肪与哮喘

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