苦参碱对人卵巢恶性畸胎瘤细胞株PA-1增殖及凋亡的影响

摘要

目的：通过培养PA-1细胞,并且进行苦参碱(MAT)干预,观察其作用后细胞的形态变化,检测其增殖活力的变化,同时检测一些凋亡相关基因在肿瘤细胞中的表达水平的变化,从细胞分子生物学的水平观察MAT处理PA-1细胞后,各个因子在凋亡发生过程中的作用,初步探讨PA-1细胞凋亡的机制,为MAT对该肿瘤的临床治疗提供基础研究. 方法：本实验的细胞购自中国协和医科大学基础医学院,为ATCC细胞库收录. 1.对PA-1细胞进行复苏和传代培养,通过细胞计数,计算其DOT(倍增时间). 2.用不同浓度的MAT处理细胞,分别在处理后不同的时间点,以MTT法检测MAT对PA-1细胞增殖活性的影响. 3.用光学倒置显微镜从形态学的角度研究PA-1细胞在MAT诱导凋亡前后的显微结构特征的变化. 4.用DAPI染色检测细胞形态学变化. 5.Annexin V FITC和PI双染后细胞样品置于免疫荧光显微镜下观察细胞形态. 6.用流式细胞术测定不同浓度MAT对细胞凋亡的影响. 7.用流式细胞仪测定不同浓度MAT对细胞周期的影响. 8.用半定量RT-PCR检测MAT诱导凋亡过程中人类凋亡受体Bcl-2/Bax的表达水平的变化,以β-actin为内参照,目的基因的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标. 结果：1.经复苏以后的PA-1细胞增殖稳定,以1:8的比率传代,隔天换液一次,3天传代一次.细胞群体倍增时间为26h. 2.光镜结果显示加药组细胞数量比对照组明显减少,形态皱缩,胞内明显出现圆形空泡,且呈剂量依赖性,而正常组与对照组细胞无明显变化. 3.MTT法检测发现,MAT作用后细胞的增殖受到了抑制,随着浓度和时间的增加,其抑制作用增强,与对照组比较有显著性差异(P<0.05). 4.DAPI染色显示MAT作用24h后,1.0、0.5、0.25mg/ml浓度组中可见较多明显的核固缩,且核固缩的比例依浓度呈现一定的梯度,而对照组中未见明显的核固缩,证实MAT有诱导细胞凋亡的作用. 5.可见Annexin V FTTC仅着色于细胞膜表面的早期凋亡细胞(图6.)及Annexin V FITC和PI均着色于细胞上、整个细胞浓染的晚期凋亡细胞(图7.),证实MAT有诱导细胞凋亡的作用. 6.流式细胞仪检测结果显示,MAT作用24h后对PA-1细胞有明显的诱导凋亡作用,且在1.0、0.5、0.25mg/ml浓度组中,凋亡率与药物浓度成正比,且有统计学意义(P<0.05). 7.流式细胞仪检测结果显示,经MAT作用后G<.1>期细胞比例均增高,S期细胞比例降低,其差异具有统计学意义(P<0.05).且在1.0、0.5、0.25mg/ml浓度组中G<,1>期阻滞作用与药物浓度成正比. 8.RT-PCR结果显示经不同浓度的MAT处理后的PA-1细胞的bc1-2/baxmRNA表达水平均下调.且呈浓度依赖性. 结论：1.MAT对PA-1细胞有明显抑制作用,且表现出良好的剂量和时间效应关系,其抑制作用与药物浓度和作用时间成正比.其机制可能是通过细胞周期影响增殖.2.MAT对PA-1细胞有诱导凋亡作用,且表现出良好的剂量效应关系,其诱导作用与药物浓度成正比. 其诱导凋亡机制可能与Bcl-2和Bax基因相关.

目录

缩略词表

主要仪器设备

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

苦参碱类生物碱抗肿瘤机制研究进展

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