银杏提取液对随意型皮瓣成活影响的实验研究

摘要

目的：
　　 研究银杏提取液促进随意型皮瓣成活可能的机制，并对银杏提取液的药理机理及运用进行初步探讨。
　　 方法：
　　 1．皮瓣模型的构建：
　　 将健康SD大鼠随机分为银杏提取液组（实验组）和生理盐水组（对照组），根据文献报道，采用改良的“Mc Farlaneflap”模型，麻醉后以大鼠尾部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一宽3cm、长9cm超长矩形随意型皮瓣。在皮瓣肉膜深层钝性分离组织，结扎皮瓣基底部的知名血管。皮瓣制作完成后用医用慕丝缝线间断缝合，术后抗炎抗休克治疗，两组在手术后2小时腹腔注射药物或生理盐水。实验组每只大鼠每日腹腔注射银杏注射液100mg/kg，对照组每只大鼠每日腹腔注射等量生理盐水。
　　 2．皮瓣大体观察：
　　 每日对皮瓣成活进行肉眼大体观察，具体包括皮瓣颜色、组织弹性、质地。
　　 3．皮瓣成活面积计算：
　　 术后第7天，两组大鼠在麻醉状态下用透明纸准确描记皮瓣成活及坏死面积，用SONY数码相机拍摄带有尺度标记的照片，然后导入计算机，以Image-ProPlusv6.0软件测量皮瓣成活面积和总面积，利用公式(皮瓣成活面积比=皮瓣成活表面积/皮瓣总表面积×100％)，计算两组皮瓣成活面积比。
　　 4．微血管造影：
　　 取实验组和对照组各2只共4只大鼠进行微血管造影术。参照楼新法等人的操作方法，先通过往一侧颈动脉灌注0.9％生理盐水，同侧颈静脉放血的方法排尽大鼠体内血液，然后将预置的明胶+氧化铅灌注液按照100ml/kg的量缓慢注射入颈动脉，当观察到大鼠巩膜及四肢末端色泽变成造影剂颜色后停止注射。灌注成功后将大鼠冷藏12-24h，使明胶凝固。最后将大鼠背部皮瓣及周围皮肤解冻后完整解剖，平铺行X线摄影，观察皮瓣血管化程度。
　　 5．HE染色及相关指标检测：
　　 将两组其他20只大鼠的皮瓣分为三等分，为近蒂部成活区（Ⅰ区）、皮瓣坏死与成活并存区（Ⅱ区）、皮瓣远端坏死区（Ⅲ区）[1]，切取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区组织标本，浸泡于10％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，制成4微米厚的切片，用于HE染色及免疫组化检测。HE染色后在低倍镜下观各区域组织水肿、坏死，炎症细胞浸润等情况。高倍镜下观察实验组和对照组Ⅰ区和Ⅱ区微血管密度情况。
　　 6．免疫组化及相关指标检测：
　　 通过免疫组化的方法检测血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达及分布情况。采用二步法对两组Ⅱ区组织切片进行染色，每张片子选择染色均匀的区域，于40×10倍光镜下观察，每张片子取五个视野拍摄保存，在拍摄过程中，设置白平衡、快门时间等参数一致。将保存的图片导入Image-ProPlusv6.0软件，通过对图片阳性表达的累积光密度值(IOD)进行测量，作为评价生长因子表达的指标。
　　 结果：
　　 1．皮瓣大体观察：
　　 术后第1天两组皮瓣出现不同程度的皮肤肿胀、远端暗紫色，但无明显坏死。术后第3天，皮瓣中、远端开始出现局部灶状、小片状坏死，坏死部分颜色多为红褐色，有淤血。至术后第7天两组皮瓣中、远端坏死部分趋于融合，有黑色痂壳出现，手感变硬，皮瓣分界基本稳定。
　　 2．皮瓣成活面积计算：
　　 经软件测量，7天后实验组和对照组的皮瓣面积均有不同程度地萎缩，实验组皮瓣面积平均为(25.67±1.12)cm2，对照组的皮瓣面积平均为(25.85±1.02)cm2，两者比较无明显统计学差异。实验组成活面积(17.35±1.25)cm2，对照组成活面积(12.47±0.71)cm2，两者比较P＜0.01，有显著统计学差异，最后得出实验组皮瓣成活面积比(67.07±3.48)％，对照组成活面积比为(48.64±2.09)％，两者比较P＜0.01，有显著统计学差异。
　　 3．微血管造影：
　　 在X线下可观察到大鼠背部皮肤血管灌注良好，小血管显影清晰。两组皮瓣血管化范围与皮瓣成活范围较为一致，皮瓣远端无血管存在，皮瓣近、中端血管显影程度较周围皮肤有所增高，实验组的血管显影范围较对照组范围大。
　　 4．HE镜下观察及指标检测：
　　 低倍镜下观察到皮瓣Ⅰ区可见正常皮肤结构，表皮层与真皮层界线清晰，无明显炎症细胞浸润；皮瓣Ⅲ区出现均质样改变，大量炎症细胞浸润，皮肤附属器如毛囊结构破坏，组织水肿明显；低倍镜下对照组Ⅱ区表皮变性萎缩明显，皮下组织水肿，炎性细胞侵润严重，实验组Ⅱ区表皮变性不明显，皮下组织可见水肿，炎性细胞侵润较轻。高倍镜下微血管密度可见实验组和对照组Ⅰ区为(31.25±2.92)个/mm2和(30.75±4.33)个/mm2；11区为(22.0±2.16)个/mm2和(18.38±3.62)个/mm2，两组皮瓣Ⅱ区的微血管密度比较P＜0.05，差异有统计学意义。
　　 5．免疫组化指标检测：
　　 免疫组化结果通过软件计算累计光密度值(IOD)，得到实验组VEGF阳性量为9686.57±430.06，对照组为4363.05±391.67。实验组bFGF阳性量为5352.83±462.12，对照组为3016.45±227.08，经统计学分析，两组结果均有显著的差异(P＜0.01)。
　　 结论：本实验表明，在皮瓣坏死与成活并存的Ⅱ区，银杏提取液实验组出现大量新生血管，微血管密度增加，明显提高了皮瓣的成活面积，这提示银杏提取液可能通过激活体内某些复杂的调控通路，增加皮瓣局部VEGF和bFGF的表达，从而增加皮瓣局部新生血管程度、血管密度，最终提高了皮瓣的成活。