小鼠下颌下腺发育晚期关键基因的筛选及其功能预测

摘要

对于哺乳动物来说，涎腺是非常重要的器官。其分泌的唾液主要作用为：对咀嚼和发声起润滑作用，辅助消化和味觉，对口腔PH起缓冲作用。涎腺的发育是一个动态连续的过程，从概念上讲，涎腺发育分为4个阶段[1]：1、在上皮芽阶段，邻接舌的口腔原始上皮在周围间充质的诱导下增厚(E11.5，E12.5)，突入间充质，形成下颌下腺初始上皮芽。随着继续发育和细胞增殖，下颌下腺原基成为一实性狭长的上皮条索，末端形成一球状突起。2、在假腺管阶段，实性上皮条索继续延长并且反复分支，突入周围间充质。这一阶段继续发展，间充质被细胞外胶原基质，纤连蛋白及特有的蛋白质所分隔，变的疏松。3、在小管阶段，上皮突逐渐增加，假性管道出现明显的管腔，并且间充质变得更加疏松。4，在顶芽阶段，假性腺管逐渐出现明显发育良好的管腔，顶芽。顶芽晚期，管腔内与基底表面的间充质只隔一层矮立方细胞。涎腺的发育过程并非截然分开，某一阶段以某些形态结构特征为主，同时兼并有其它相近阶段的形态结构成分。
　　 在涎腺发育过程中，基因起到决定做用。已有研究表明，上皮芽阶段，Fgfl0基因敲除的小鼠体内，没有涎腺的形成，杂合体小鼠也会出现涎腺的发育不全，表现涎腺导管及顶芽的减少[2，3]。假腺管阶段，在Shh基因敲除老鼠，涎腺发育不能顺利度过假腺管初期阶段[4]。但涎腺发育还有很多未知的领域。需要进一步探索。
　　 目的：本实验以小鼠发育晚期下颌下腺为研究对象，筛选涎腺发育晚期关键基因。从分子水平上研究涎腺在出生前后两个不同环境中，关键基因对涎腺发育晚期的作用，为揭示下颌下腺发育晚期的分子学机制奠定一定的基础。
　　 方法：1，选取小鼠胚胎第18.5天、19.5天，出生后当天、出生后3天同胞胎鼠，解剖分离下颌下腺。2，对四个标本进行基因芯片检测.采用BeadStation500System扫描仪(illumina，Inc.)对芯片扫描，BeadStudioGeneExpressionModule图像分析软件（illumina，Inc.）对芯片灰度扫描图进行分析，构建小鼠下颌下腺的全基因表达谱。3，生物信息学STC法分析基因表达趋势，多重比较检验的统计方法，显著性趋势的筛选标准：P＜0.05/26=0.0019。建立发育时间与基因表达相关的调控网络图，从网络中筛选关键基因，预测其基因功能，4，对关键基因Skp2进行实时荧光定量PCR验证。
　　 结果：1，4个时期的下颌下腺标本的质检合格。2，基因芯片检测，得到全基因表达谱。应用生物信息学STC法，差异基因表达变化的总共有26种趋势，其中有8个趋势是显著性的表达趋势(P＜0.0019)，其中有4种与表型相关。构建网络图筛选关键基因，得到Ddxll、Cenpl、Fanci、Skp2、Rbm4、Dak。Skp2与胚胎期细胞的分化、增殖密切相关。3，E18.5，E19.5，PO，P34个时期的关键基因平均信号值为：
　　 Ddxll1273.908,915.268,652.392,592.034
　　 Cenpl1600.473,1199.375,939.113,780.825
　　 Fanci133.575,94.375,63.778,47.284
　　 Skp2834.072,564.112,346.008,207.951
　　 Rbm42138.286,1752.583,1367.055,1083.388
　　 Dak347.480,250.963,177.987,151.427
　　 4，Skp2基因检测数据与实时荧光定量PCR验证结果一致。
　　 结论：小鼠胚胎晚期，六个关键基因(Ddx11、Cenpl、Fanci、Skp2、Rbm4、Dak)在下颌下腺发育过程当中作用活跃，出生后作用逐渐减弱。六个关键基因在涎腺发育过程当中起重要作用，为涎腺组织工程奠定实验基础。