基于假病毒系统的三株流感病毒膜蛋白HA/NA重配特性的研究

摘要

目的:
　　 本试验在逆转录病毒载体基础上，采用构建的流感病毒假病毒颗粒，进行研究流感病毒不同株型之间膜蛋白HA/NA重配的特性，为新型流感病毒的预防与抗体研制提供科学的理论依据。
　　 方法:
　　 1．三组HA/NA氨基酸序列的比对
　　 我们通过人工方法对三组HA/NA氨基酸序列进行了对比，以H3N2HA和H3N2NA为模板进行比对，AHH5N1HA/NA和2009H1N1HA/NA中与之相同的氨基酸序列以“．”代替，并对比对序列做以标记。
　　 2．质粒构建
　　 通过酶切、PCR等方法从原始质粒上获取不同株型的流感病毒膜蛋白HAs/NAs的cDNA片段，然后将获得的不同cDNA片段克隆至pVRC表达载体形成表达质粒(pCMV-HA/NAexpressionplasmid)。
　　 3．流感假病毒颗粒的制作
　　 假病毒颗粒的制作是将pVRC-HA/NA表达质粒，Gag-Pol包装质粒(Gag-polexpressionplasmid)和EGGP报告质粒（Reporterexpressionplasmid）三种质粒共转染至293T细胞内，72小时后从上清中收取假病毒颗粒（pseudotypedparticle，pp）。
　　 4．假病毒颗粒表达量的评价
　　 于转染后293T细胞上清中收取假病毒颗粒，用qPCR定量不同重配的假病毒颗粒的拷贝数。
　　 5．假病毒颗粒感染力的评价
　　 过滤的pps按qPCR定量结果将不同假病毒颗粒调整至同一拷贝数水平后进行感染试验，感染72小时后胰酶消化悬浮后通过流式细胞仪点取GFP表达的A549细胞数量用于假病毒颗粒感染力的评价。
　　 6．假病毒颗粒血凝试验
　　 将九种pps根据qPCR结果调整至同一拷贝数水平进行血凝试验。
　　 7．不同流感假病毒颗粒HA/NA蛋白表达的评价
　　 评价上清中假病毒颗粒中HA/NA的表达情况，取同量未调整的样品加入4×LDS上样缓冲液水煮5分钟后跑SDS-PAGE胶，电转至PVDF膜上显色观察。
　　 结果:
　　 1．三组HA/NA氨基酸序列的对比
　　 在HA的586个氨基酸序列中，2009H1N1HA有325(55.46％)个氨基酸序列不同，AHH5N1HA有328(55.97％)个氨基酸序列不同。2009H1N1HA、H3N2HA、AHH5N1HA三株HA的氨基酸序列中糖基化位点数分别为6、12、9个，在190、194、226处H3N2HA的氨基酸不同于其余两株，分别被D、I和Q替代。在NA的480人氨基酸序列中，2009H1N1NA和AHH5N1NA分别有260(54.28％)、248(51.77％)个序列不同。H3N2NA、2009H1N1NA和AHH5N1NA分别含有8、6、3个糖基化位点，在151序列处H3N2NA的氨基酸被D替代。
　　 2．qPCR结果
　　 在转染条件一致的情况下，带有AHH5N1HA的pps在同样时间内分泌的假病毒颗粒拷贝数明显多于带有H3N2HA和2009H1N1HA的pps。其中带有H3N2HA的pps分泌最少。
　　 3．血凝结果
　　 带有AHH5N1HA和2009H1N1HA的pps血凝大致相同，而带有H3N2HA的pps滴度未测出。
　　 4．九种pp感染力
　　 根据qPCR结果调整至同一拷贝数水平后的九种pps感染力：其中带有AHH5N1HA的pps感染力明显高于带有H3N2HA和2009H1N1HA的pps。其中带有H3N2HA的pps感染力最低。
　　 5．pps中HA/NA蛋白表达评测结果
　　 在pps中的HA表达中，2009H1N1HA与AHH5N1HA在分子量和糖基化类型上与各自对应的灭活真病毒十分相似。而在H3组合中，假病毒颗粒的糖基化明显不同于灭活真病毒(H3N2(W))，并且H3N2HA的分子量明显大于2009H1N1HA和AHH5N1HA，在138KD和66KD之间，灭活真病毒要比假病毒多出一条带。在所有假病毒中可以看到HA0都有明显的表达，而在AHH5N1HA组合中，HA0的活化类型明显多于其余两种HA。
　　 在pps中的NA表达中，H3N2NA2009H1N1NA与AHH5N1NA在分子量的大小和类型上有明显的不同，H3N2NA主要表达为四聚体，三聚体和单聚体，2009H1N1NA主要表达为单聚体和三聚体，而AHH5N1NA却主要表达为单聚体。
　　 结论:
　　 运用假病毒颗粒技术平台，可以在不同株型（亚型）的流感病毒间重新排列重配可以产生具有感染力的新病毒株。在假病毒颗粒和野生型病毒的HAs中表达量最高的是前体HA0。NAs中H3N2NA主要表达为四聚体，2009H1N1NA主要表达为二聚体，而AHH5N1NA主要为单聚体。四聚体，二聚体和单体NAs都具有生物学功能，都可以在病毒生命周期中发挥作用。在重配实验中，AHH5N1HA可以与其它NAs重配形成高感染力的病毒颗粒。