rVvhA功能模序膜成孔的预测及细胞毒作用机制分析

摘要

目的： 1、研究创伤弧菌溶细胞素(VVC)，的相关功能模序及其生物学活性。 2、研究VVC膜成孔多肽对Hela细胞的成孔作用，研究ROS变化和线粒体信号通路在VVC膜成孔多肽诱导人Hela细胞损伤中的作用。 3、进一步完善溶细胞素致病机制研究，并为今后开发新型细胞转染试剂等功能开发研究奠定基础。 方法： 1、创伤弧菌溶细胞素VVC的功能模序的预测与分析用BLAST、motif scan、Inter-pro，SWISS-MODEL对创伤弧菌溶细胞素基因和氨基酸序列进行分析比对，并结合相关文献寻找相应功能模序，同时用motif scan等生物信息软件对VVC进行二级结构和三级结构预测分析。最终对创伤弧菌溶细胞素膜成孔Motif进行预测。 2、构建原核表达系统pET28a(+)-mpf以含pET-28a(+)-vvhA中的rVvhA基因为模板，设计合适的引物进行PCR扩增出目的基因 mpf，将目的基因亚克隆入pET-28a(+)载体质粒中，再进一步转化入宿主E.coli BL21(DE3)中，限制性内切酶双酶切及测序鉴定转化成功后的质粒其序列是否正确。 3、重组体的诱导表达及融合蛋白的复性与纯化 IPTG诱导含pET-28a(+)-mpf重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白rMpf，应用三步洗涤结合Ni2+亲和层析方法对rMpf进行纯化，利用稀释复性加分步透析相结合的方法进行蛋白质复性。 4、蛋白功能活性检测复性后蛋白作用于Hela细胞，相差显微镜下观察细胞形态变化，CCK-8检测细胞存活率，透射电镜技术观察细胞超微结构变化，DiI细胞膜荧光探针和Mito-green线粒体荧光探针结合荧光显微镜观察rMpf作用后荧光分布变化；流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡与坏死率；JC-1检测细胞线粒体膜电位变化；MPTP测定膜通道孔的形成与变化；DCHF-DA荧光探针，检测其胞内ROS产生的动态变化。 结果： 1、通过利用生物信息学技术预测到创伤弧菌溶细胞素中含有膜成孔多肽模序，为VVC的141-335氨基酸片段该模序中含有过氧化物酶活化位点、溶血区域以及钙蛋白结合位点，对应的核酸序列是585bp。 2、对该核酸序列进行原核克隆，将其重组入pET-28a(+)表达载体中，得到原核表达系统pET-28a(+)-mpf。克隆得到的工程菌E.coli BL21(DE3)双酶切及测序鉴定结果均表明这一系统与预期设计相同。 3、含pET-28a(+)-mpf重组质粒的BL21大肠杆菌经0.5 mmol/L IPTG诱导后表达的融合蛋白 Mr为27kDa，电泳结果与该融合蛋白的理论推算值基本相符。表达的蛋白质经三步洗涤与Ni2+-NTA柱纯化后，其纯度达95.0％左右。纯化的rMpf稀释复性后证明具有细胞溶解活性。 4、rMpf融合蛋白作用Hela细胞，其细胞和线粒体形态发生凋亡甚至坏死表现。CCK-8显示融合蛋白rMpf可抑制细胞增殖，降低细胞的存活率，且呈剂量依赖性。rMpf融合蛋白结合到膜结构，其过氧化物酶活化位点脂质过氧化作用可使膜酶受到损伤、膜的通透性增加、膜受体失活、膜的流动性下降，正常难以透过的物质如Ca2+的通透性增加，而膜对Ca2+通透性的增加可进一步加重氧自由基对线粒体膜的损伤。线粒体膜系统的损伤可导致是ROS对线粒体膜、线粒体膜蛋白的氧化损伤，线粒体膜电位下降，ROS产生增多，TP开放，线粒体外膜破裂，导致细胞凋亡。 结论： 本实验利用生物信息学技术与手段预测到了VVC中含有膜成孔肽模序，并成功地对这段模序的核酸序列进行原核克隆，构建得到pET-28a(+)-mpf表达系统，分离纯化且成功复性得到具有生物学活性的融合蛋白rMpf。对其生物活性鉴定证实rMpf融合蛋白对膜结构有损伤作用，而且有细胞毒作用，通过对膜结构的破坏，进一步参与线粒体通路的细胞凋亡途径，导致细胞凋亡或坏死。为研发细胞转染试剂提供一些依据。