EB病毒LMP2T、B细胞重叠表位的预测、筛选及鉴定

摘要

目的： 基于本实验室对EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2(EB Latentmembrane protein2，LMP2)B细胞表位筛选的结果，对已筛选的3个免疫优势B细胞表位及其上下游的氨基端肽段预测其T表位，进一步筛选和鉴定EBV LMP2 T、B细胞重叠表位，为其单克隆抗体的制备及EBV相关肿瘤免疫防治研究提供理论依据。 采用SYFPEITHI细胞表位在线预测服务(http：//www.syfpeithi.de/)。运用SYFPEITHI服务器上的EPITOPE PREDICTION方法，在本实验室已筛选的3个B细胞优势表位及其上下游分析预测MOMP的HLA-A*0201限制性细胞毒T细胞(cytotoxicity T cell，CTL)表位。根据筛选肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分，选择分值较高的氨基酸肽段为免疫优势T细胞表位，即为EBV LMP2 CTL表位和B细胞重叠表位，并进一步对筛选的T、B细胞重叠表位进行鉴定和免疫效应的研究。 方法： 1.EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL和B细胞重叠表位的预测 从SwissProt蛋白数据库获得EBV LMP2的氨基酸序列，以数据库Syfpeithi、NetCTL为主、并结合HLA-Bind、Rankpep等在线软件，对本实验室已鉴定的3个EBV LMP2免疫优势B细胞表位及其上下游肽段，分别预测EBV LMP2中HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位，结果其中2个B细胞表位上下游分别重叠含CTL表位，选择CTL和B细胞表位重叠的EBV LMP2中的氨基酸短肽，作为T、B细胞重叠优势表位为目的表位进行鉴定，并进一步进行免疫效应的研究。 2.表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成，采用高效液相色谱法HPLC纯化及进行质谱法分析鉴定。 3.CTL和B细胞重叠表位肽的鉴定 对上述合成的CTL和B细胞重叠表位肽作进一步鉴定。 (1)重叠表位肽的CTL表位活性鉴定：①利用T2细胞分析预测的重叠肽与HLA-A*0201分子结合的亲和稳定性；②利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，检测重叠表位肽诱导的体外细胞毒杀伤活性；③通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色(ICS)方法，检测重叠表位肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFNγ水平，鉴定EBVLMP2的HLA-A*0201限制性CTL表位的活性。 (2)重叠表位肽的B细胞表位活性鉴定：利用动物免疫的方法，即采用纯化的合成肽偶联BSA，在BALB/C雌性小鼠(5只/组)后背部皮下多点免疫注射，以沙眼衣原体(ct)主要外膜蛋白(MOMP)表位肽偶联BSA为对照，共免疫3次，间隔两周，于免疫第0w，1w，3w，5w，7w，9w周分别收集血清，制备免疫血清抗体。采用间接ELISA方法检测重叠表位肽在不同免疫时间段的抗体效价，免疫原性，及其诱导抗体与EBV抗原的结合能力是否受CTL表位存在的影响。 结果： 1.CTL和B细胞重叠表位预测结果及初步筛选 根据Syfpeithi预测，以本实验室对EBV LMP2的B细胞表位鉴定结果为基础，选择含分值较高的HLA-A*0201限制性CTL表位RIEDPPFNSL(199～208)、LSSTEFIPNL(383～392)作为目的CTL和B细胞重叠表位肽，分别命名为EBp13、EBp14。同时以HLA-A24限制性表位肽TYGPVFMCL(419～427)作为阴性对照，以HLA-A*0201限制性CTL表位肽LLWTLVVLL(329～337)作为阳性对照，分别命名为EBp11和EBp12。 2.重叠表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案合成，经高效液相色谱法HPLC纯化，以此获得纯度接近或高于95％的肽产物，经质谱法MS鉴定氨基酸的序列，同时测定分子量，所得测定值与理论值相符。成功获得了高纯度的合成肽EBp11、EBp12、EBp13和EBp14，为进一步表位鉴定奠定了基础 3.重叠表位肽的进一步鉴定 (1)肽亲和稳定实验结果：显示重叠表位肽EBp13、EBp14与T2细胞的结合亲和力(FI)分别为3.21、2.24，稳定性DC50均>8h；阳性肽EBp12与阴性肽EBp11的亲和力(F1)分别为5.00和1.58，稳定性DC50分别为>8h和<2h。本实验筛选的EBp13和EBp14与T2细胞的结合的亲和力以及稳定性与与阴性对照肽有显著性差异(P<0.05)，但与阳性对照肽均无显著差异(P>0.05)。 (2)LDH释放试验结果：利用HLA-A2阳性个体的外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞，以T2细胞为靶细胞，结果当效靶比(E：T)为40:1及20:1时。PBMC对负荷EBp13和EBp14的T2细胞的杀伤率分别为(20.37±1.53)％、(14.63±2.01)％及(21.08±1.79)％、(15.99±1.98)％，与阴性对照组(10.86±1.49)％、(10.08±2.02)％比较，对抗原的特异性杀伤活性均具有统计学意义(FEBp13=104.213，P<0.05；FEBp13=87.332，P<0.05及FEBp14=112.207，P<0.05；FEBp14=91.241，P<0.05)。 (3)ELISPOT法检测结果：针对EBp13、EBp14两条表位肽刺激产生IFNγ特异性CTL频数均数分别为253.00±23.00、280.00±24.00(SFC*/105)，阳性肽与阴性肽的特异性CTL频数均数分别为345.00±22.00和9.00±8.00(SFC*/105)。结果显示EBp13、EBp14形成的斑点数与阳性肽无显著差异(FEBp13=41.843，FEBp14=56.631，P>0.05))，与阴性对照差异显著(FEBp13=378.213，FEBp14=398.419，P<0.05) (4)流式细胞仪分析结果：通过IFNγ+CD8+双阳性细胞的数目变化来判定所合成的肽可否刺激PBMC增殖，进而确定这些肽在HLA-A2个体PBMC中诱导抗原特异性CTL的能力，以此鉴定其是否为具有特异性的CTL表位。结果表明，经EBp13、EBp14刺激后，IFNγ+CD8+双阳性细胞数分别为阴性肽刺激组的1.3倍及3倍。 (5)间接ELISA方法检测结果：显示筛选的重叠表位肽均能刺激小鼠产生抗体；抗体效价随免疫次数增加而升高；所诱导产生的抗体均能与EBV抗原结合。EBp13和EBp14免疫制备的抗体效价均较对照组抗体效价高，实验组和对照组血清的吸光度值之比(S/N)大于2.1。用t检验分析，EBp13和EBp14免疫获得的抗体效价与ct-MOMP表位肽偶联BSA阴性对照免疫获得的抗体效价均有显著性差异(FEBp13=112.323，FEBp14=132.541，P<0.01)；EBp13与EBp14免疫获得的抗体效价无显著差异(F=76.353，P>0.05)。 结论： 1.预测并筛选了2个可能的EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL和B细胞重叠表位，并委托合成。 2.EBp13、EBp14两条重叠表位肽与T2细胞上的HLA-A*0201分子有较高的亲和力和稳定性，并能够刺激HLA-A2阳性个体的PBMC增殖并具有特异性杀伤活性，同时也能够分泌IFN-γ。表明，筛选的重叠表位肽具有较强的CTL活性。 3.EBp13、EBp14两条重叠表位肽刺激小鼠体产生较强的EBV特异性的抗体反应。表明，筛选的重叠表位肽具有较强的免疫原性。