外源性Hsp72抑制大鼠坐骨神经创伤修复中的雪旺细胞凋亡及其机制的实验研究

摘要

目的：探讨外源性Hsp72在大鼠坐骨神经创伤修复中抗雪旺细胞凋亡的作用及其分子机制。 方法： 1.Western blot检测大鼠雪旺细胞表达Bax和Bcl-2蛋白水平的变化：(1)雪旺细胞加入H2O2溶液培养不同时间后检测，建立H2O2诱导凋亡的雪旺细胞模型；(2)加或不加Hsp72干预，雪旺细胞H2O2诱导凋亡26h后检测。 2.利用成年雄性SD大鼠坐骨神经横断再缝合复制坐骨神经创伤修复模型。将50只SD大鼠随机分成4大组，包括：正常对照组(5只)、PBS对照组(15只)、低剂量组(15只)、高剂量组(15只)。除正常对照组外，其他每个大组又分为4d组、14d组、21d组3个小组，每小组5只。每只大鼠随机选择一条后肢作为实验肢。坐骨神经切断缝合后，PBS对照组在局部注射PBS溶液50μl，低剂量组局部注射0.1μg/μl Hsp7250μl，高剂量组局部注射0.4μg/μl Hsp7250μl。正常对照组、4d组、14d组、21d组分别在0d、4d、14d、21d行坐骨神经功能指数(SFI)检测，处死大鼠并切取坐骨神经缝合点远端标本，检测各组神经纤维形态学改变，雪旺细胞S-100蛋白和凋亡基因相关产物Bcl-2表达水平变化，并用TUNEL法检测雪旺细胞凋亡指数。 结果： 1.细胞实验部分： (1)外源性Hsp72对H2O2诱导凋亡的雪旺细胞表达Bax和Bcl-2蛋白水平的影响：与H2O2组比较，外源性Hsp72能显著提高雪旺细胞表达Bcl-2蛋白的水平，且成一种剂量依赖状态，即在一定的Hsp72浓度范围内Bcl-2蛋白表达水平随Hsp72浓度的增高而增高，但对雪旺细胞表达Bax蛋白未见影响。 2.动物实验部分： (1)4d、14d、21d3个时相点，PBS对照组、低剂量组、高剂量组间坐骨神经功能指数差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)S-100蛋白的表达量，4d时PBS对照组、低剂量组、高剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)，三者呈逐级递增状态。14d时PBS对照组、低剂量组、高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。21d时低剂量组和高剂量组低于PBS对照组(P<0.05)。 (3)凋亡抑制基因产物Bcl-2蛋白的表达量，4d时PBS对照组、低剂量组、高剂量组间差异有统计学意义(P=0.000)，且三者呈逐级递增状态，高剂量组表达量明显高于PBS对照组和低剂量组。14d、21d时PBS对照组、低剂量组、高剂量组间差异无统计学意义(P<0.05)。 (4)TUNEL法凋亡试剂盒原位检测显示正常成年大鼠坐骨神经中雪旺细胞的凋亡发生率很低。PBS对照组、低剂量组、高剂量组在4d、14d、21d均出现大量凋亡细胞核。4d时雪旺细胞凋亡指数PBS组、低剂量组、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，且三者呈逐级递减状态。14d、2ld时PBS对照组、低剂量组、高剂量组间差异无统计学意义(P<0.05)。 结论： 外源性Hsp72可能通过上调雪旺细胞表达凋亡抑制基因产物Bcl-2蛋白，减少大鼠坐骨神经创伤修复过程中的雪旺细胞的凋亡，从而发挥对雪旺细胞的保护作用。因外源性Hsp72能减少大鼠坐骨神经创伤修复过程中的雪旺细胞的凋亡，而雪旺细胞在周围神经的修复过程中发挥重要的作用，故我们推测外源性Hsp72可能对周围神经的创伤修复具有潜在的临床治疗价值。