新合成查尔酮类衍生物的抗炎活性评价及药理机制研究

摘要

目的： 1.天然存在的查尔酮类化合物活性都较低，明显限制它的应用。我们设计合成系列查尔酮类似物，在于提高活性。 2.设计通过新合成查尔酮类似物，阻断脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放典型炎症因子白细胞介素-6和肿瘤坏死因子，评价它们的活性大小。 3.设计脂多糖诱导小鼠腹腔原代巨噬细胞炎症反应，检测新合成查尔酮类似物抑制炎症因子转录水平及对核转录因子NF-κB信号通路相关蛋白激酶磷酸化水平的抑制。 4.通过小鼠腹腔注射LPS20 mg/kg造成脓毒感染性休克模型。检测新合成查尔酮化合物体内抗炎活性。 方法： 主要的抗炎药物，甾体类和环氧化酶类，己被证实有各种副作用，如COX-1和COX-2的抑制作用无选择性，如吲哚美辛等即抑制COX-2，也抑制COX-1，甚至对COX-1的抑制作用比对COX-2的抑制作用还要强许多，因此会引起较严重的肠胃道损伤。长期服用非甾体类抗炎药的病人中，有12-30％出现胃溃疡，2-19％出现十二指肠溃疡，而原有溃疡病者，症状则会加重。通过在A环和B环上引入不同的基团，我们合成一系列的查尔酮类似物。见图1： 1.化合物抗炎活性的筛选： 各个化合物对LPS刺激巨噬细胞所释放的炎症因子TNF-α，IL-6的作用，逋过应用ELISA方法来表征。并将活性较好的六个化合物L6H3，L6H4，L6H9，L28H2，L4OH16，L6H21稀释成2.5，5，10，20mM等四个浓度进行量效关系研究。 2.Western blot方法分析： 收集处理的细胞并裂解，挑选40μg的细胞总裂解液，通过10％十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶柱分离，随后电转到硝酸纤维素膜上。每张膜在室温条件下，预先在pH7.6、含0.05％吐温20、5％脱脂牛的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中孵育一个小时。分别用p-JNK，JNK，IκB，p-p38，p38，p-ERK，ERK或者Actin等的特异性抗体反应孵育硝酸纤维素膜。免疫反应的条带和二抗(含有辣根过氧化物酶标记)结合后用加强的化学发光试剂成像。 3.分析细胞核NF-κ B p-65转移： 根据试剂制造商提供的细胞核NF-κB p-65试剂盒说明书，对细胞进行免疫荧光染色。细胞内的P65蛋白和细胞核分别被染成红色或者是蓝色，且在荧光显微镜下可被明显观察到，在其激发光光波长为350 nm时观察到DAPI，在波长540nm处可以看到抗兔Cy3抗体。当把两张红、蓝图片重重叠在一起，在红蓝重合的位置，呈现出来紫色的荧光图像。 4.脂多糖诱导B6小鼠炎症死亡率： 在37℃水浴条件下，将化合物溶解到含有链甘油三酯的聚乙二醇中。化合物浓度，调节成2 mg/mL。在最终溶液中溶剂的浓度范围是5～10％，中链甘油三酯的浓度时0.5～2％。体重范围在18-22g的雄性B6小鼠，先静脉注射化合物水溶液200μL、15 mg/kg，而对照组注射空白溶液，阳性对照组按照LPS20 mg/kg进行注射。连续7天不断检测记录实验小鼠的体重和死亡率。 5.实时定量PCR方法： 依据试剂商的操作手册，用TRIZOL试剂盒处理实验细胞。逆转录和荧光实时定量检测法，应用两步法M-MLV，SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒。使用Eppendor f Mastercycler ep realplex检测系统分析Q-PCR定量结果，TNF-α，IL-6，IL-12，IL-1β，COX-2和β-actin等的引物委托Invitrogen公司合成。 结果： QSAR研究发现在B环上存在有吸电子基团，或者是在A环上有供电子基团时，查尔酮类化合物能够显著抑制脂多糖诱导的IL-6的表达。此外化合物L6H3，L6H4，L6H9，L6H21，L28H2呈现剂量依赖性抑制TNF-α和IL-6的表达。同时L6H3，L6H4，L6H9，L6H21等六个化合物，能显著降低LPS诱导的TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-12和COX-2 mRNA上调。在作用机制方面L6H4，L6H9和L6H21干扰JNK/NF-κB信号通路，剂量依赖性的阻断ERK，p38和jnk激活。另外L6H4，L6H9和L6H21可有效的减少LPS诱导的脓毒性休克导致的死亡。L6H4，L6H9可以阻断高糖诱导的炎症细胞因子的释放。