拟南芥CDR6基因在调控铅胁迫响应中的功能研究

摘要

土壤重金属污染已成为一个严重的环境问题，其中重金属铅通过生物链累积到人类的组织和器官中，对人类健康构成严重威胁。植物修复技术与基因工程技术结合，被应用于解决土壤重金属污染问题，而该研究的关键就在于植物耐受重金属毒害的关键基因的克隆及其分子机制的认识。在前期工作中通过拟南芥基因表达谱分析，发现CDR6基因可被铅胁迫诱导表达。在此基础上，获得了一个功能缺失的突变体cdr6-1，并构建了CDR6过表达载体及转基因植株，对CDR6基因在植物应对重金属胁迫过程中的生物学功能进行了研究，主要结果如下:　　1.利用组织活性染色和qRT-PCR方法对CDR6基因的组织特异性表达进行了分析，发现该基因在拟南芥各个组织中均有表达，其中在花、茎与果荚中表达量较高，而在根、莲座叶与苞叶中表达量相对较低。　　2.利用激光共聚焦显微镜，对CDR6基因所编码蛋白的亚细胞定位进行了观察，发现该蛋白定位于细胞质。　　3.通过分子鉴定和遗传分析，获得了CDR6功能缺失的突变体cdr6-1;同时，构建CDR6过量表达载体并转化野生型植株，筛选鉴定获得CDR6过表达植株。　　4.对cdr6-1突变体与CDR6过表达株系进行了铅胁迫耐受的表型分析发现，与野生型相比，cdr6-1纯合突变体表现对铅胁迫耐受，而CDR6过表达植株表现对铅胁迫敏感。表明CDR6基因负调控铅胁迫响应。　　5.进一步分析了铅胁迫应答相关基因的表达，发现cdr6-1突变体经重金属铅胁迫处理后AtPDR12、GSH1基因的转录水平与野生型植株相比没有显著差异，而ATM3基因的转录水平与野生型相比显著增加，表明CDR6基因可能通过抑制ATM3的转录水平参与铅胁迫应答的调控。　　上述结果表明，CDR6基因参与植物对铅胁迫的应答的调控。

目录

声明

致谢

摘要

第一部分 绪论

1．1 重金属胁迫对植物的危害

1．1．1 抑制种子的萌发

1．1．2 对生长发育的影响

1．1．3 对细胞膜透性的影响

1．1．4 对植物光合作用的影响

1．2 植物对重金属胁迫的抗性机制研究

1．2．1 螯合作用

1．2．2 热休克蛋白

1．2．3 有机酸和氨基酸

1．2．4 外排

1．2．5 限制跨膜运输

1．2．6 液泡的封存

1．2．7 细胞壁和根渗出液

1．3 植物抗逆研究现状

1．3．1 干旱对植物的影响及植物的抗旱性

1．3．2 盐胁迫对植物的影响及植物的抗盐性

1．3．3 低温对植物的影响及植物的抗寒反应

1．3．4 重金属胁迫对植物的影响及抗性反应

1．4 本研究的目的和意义

第二部分 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 拟南芥材料

2．1．2 菌体和质粒载体

2．2 主要试剂

2．2．1 常用分子生物学试剂盒

2．2．2 常用酶类

2．2．3 常用生化试剂

2．2．4 常用溶液与试剂的配制

2．3 主要仪器与设备

2．4 实验方法

2．4．1 灭菌与消毒

2．4．2 拟南芥培养

2．4．3 根长和鲜重的测量

2．4．4 CTAB法提取全基因组DNA

2．4．5 Trizol法提取总RNA

2．4．6 全基因组cDNA合成

2．4．7 引物设计

2．4．8 PCR反应体系及程序

2．4．9 琼脂糖凝胶电泳检测核酸

2．4．10 PCR产物纯化(Kit)

2．4．11 回收与纯化目的条带DNA(Kit)

2．4．12 提取质粒DNA(Kit)

2．4．13 植物表达载体的构建

2．4．14 限制性内切酶双酶切

2．4．15 T4连接反应(10ul连接体系)

2．4．16 E．coli感受态细胞的制备与转化

2．4．17 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化

2．4．18 花序侵染法转化拟南芥

2．4．19 GUS染色

2．4．20 数据统计

第三部分 结果与分析

3．1 拟南芥CDR6基因的组织表达模式

3．1．1 CDR6基因的组织表达模式——GUS活性分析

3．1．2 CDR6基因组织表达模式———qRT-PCR

3．1．3 CDR6基因在铅胁迫下的表达水平变化

3．2 CDR6基因编码蛋白亚细胞定位

3．2．1 35S∷CDR6-GFP重组载体的构建

3．2．2 CDR6基因编码蛋白亚细胞定位观察

3．3 CDR6基因功能分析

3．3．1 cdr6-1突变体纯台体的鉴定

3．3．2 CDR6基因过量表达植株的获得

3．3．3 cdr6-1突变体和CDR6基因过量植株对Pb(NO3)2胁迫的响应

3．4 铅胁迫下WT和cdr6-1突变体中下游相关基因表达

第四部分 讨论与展望

参考文献