不同浓度RGD修饰纯钛表面对牙龈成纤维细胞生物学行为的影响

摘要

经过几十年的发展，口腔种植现已成为修复牙列缺损和牙列缺失的常规方法，但仍然面临着很多挑战，比如由于种植体与周围粘膜等软组织结合不良导致的种植体周围炎。国内外很多学者提出通过对种植体表面改性来增强种植体和软组织的结合，将粘附蛋白、多肽、生长因子固定在种植体的表面，增加牙龈成纤维细胞在种植体表面的粘附增殖，进而提高种植成功率。虽然这些方法对促进种植体-软组织结合起到了非常重要的作用，但是也由于稳定性、生物活性、费用等问题导致它们的临床应用受到一定限制。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）广泛存在于多种细胞外基质蛋白（比如:玻连蛋白、纤维蛋白、胶原、层粘连蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白等）中，被认为是目前应用最广泛、最有效的促粘附多肽。RGD在成骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞中的生物活性已经得到了很好的证明，但是对原代培养的人牙龈成纤维细胞的影响研究较少。RGD的生物活性跟其浓度有关，但对于RGD促进细胞粘附的最佳浓度，国内外尚无定论。本研究旨在研究不同浓度的RGD对体外培养的牙龈成纤维细胞生物学行为的影响。
　　 [目的]
　　 应用羰基二咪唑(1，1'-carbonyldiimidazole，CDI)将RGD短肽化学连接到纯钛表面，观察人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGF）在组装了不同浓度RGD的钛片上的粘附、增殖和铺展情况。
　　 [方法]
　　 1、采用酶消化组织块法（翻瓶法）进行人牙龈成纤维细胞的原代培养，反复贴壁法和酶消化方法进行细胞纯化。取第4代细胞，采用免疫组化SP法鉴定细胞来源，血球板计数法描绘生长曲线。
　　 2、将直径20mm、厚度1mm的圆形钛片，表面经金相砂纸逐级打磨（280#～3000#），方向一致，经双蒸水、无水乙醇、丙酮、双蒸水分别超声清洗15分钟，去离子水漂洗，高温高压消毒。用CDI将不同浓度的RGD共价连接到钛片上。
　　 3、将HGFs在不同浓度的RGD-钛片上分别培养3小时、24小时，倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞骨架，使用Image-Pro Plus软件测量细胞的铺展面积和形状学系数。
　　 4、将细胞在不同浓度的RGD-钛片上分别培养1小时、3小时、12小时、24小时、48小时和72小时后，中止培养，加入400ul含10％的CCK8溶液，继续培养3小时，测定450nm波长时的吸光度值，以测定细胞的粘附和增殖。
　　 [结果]
　　 1、组织块贴壁5-7天后，倒置相差显微镜下可见组织块周围有细胞游出，呈长梭形或多角形，放射状生长。2周左右长满瓶底，可进行传代。免疫组化染色显示抗波形蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，空白对照未见阳性染色结果，提示该细胞来源于中胚层，无上皮来源细胞。细胞生长曲线呈S型，接种24小时后，细胞数量略有下降，随后生长加快，5-6天细胞数目达到高峰，7天开始进入平台期，生长缓慢。
　　 2、肉眼见打磨过的钛片表面光滑如镜，倒置荧光显微镜下见绿色荧光亮点分布在钛片的表面，说明RGD成功组装到钛片上。
　　 3、倒置荧光显微镜下可见各组细胞生长良好，随着时间的延长细胞数目不断增加，细胞铺展面积逐渐增大，呈RGD浓度依赖性。随着RGD浓度的增加，细胞形状学系数逐渐减小，说明RGD-钛比纯钛表面粘附性更好。在3小时和24小时两个时间点，RGD-钛上生长的细胞细胞骨架组织要比纯钛表面的粗大。
　　 4、CCK8法测细胞粘附和增殖显示:RGD在每个时间点都可以促进人牙龈成纤维细胞的粘附和增殖，并且呈浓度依赖性和时间依赖性。
　　 [结论]
　　 1、采用酶消化组织块法（翻瓶法）对人牙龈成纤维细胞进行原代培养，可以培养出足够的人牙龈成纤维细胞，用4-9代细胞进行实验，细胞活性强，形状稳定。
　　 2、经打磨后的钛片，表面光滑，符合临床种植体颈部生物学封闭的要求。通过CDI共价结合，可以成功将RGD组装到钛片的表面。
　　 3、RGD可以明显促进人牙龈成纤维细胞在钛片上的生长、粘附和增殖，并呈浓度依赖性。

目录

中英文缩略对照表

摘要

前言

材料与方法

1 主要仪器与试剂

2 实验方法与步骤

结果

1 原代培养人牙龈成纤维细胞形态学观察

2 人牙龈成纤维细胞的免疫学鉴定

3 细胞生长曲线

4 接枝到纯钛表面的RGD肽的检测

5 不同浓度RGD对HGFs在钛片表面粘附的影响

6 不同浓度RGD对HGFs在钛片表面增殖的影响

7 不同浓度的RGD对钛片表面牙龈成纤维细胞形态的影响

8 细胞形状学系数和铺展面积

9、细胞骨架检测

分析与讨论

总结

参考文献

附录：个人简历及研究成果

致谢

综述 RGD在种植体骨结合和软组织结合中的应用

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