SARS冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素氧化酶CYP450(CYP4F3A)酶活性影响的研究

摘要

核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的主要结构蛋白之一,与病毒RNA结合形成核衣壳,能够诱导强烈的细胞免疫和体液免疫,在SARS的诊断和预防上具有重要的应用。与其它冠状病毒N蛋白不同,SARS-CoV N蛋白定位于细胞质,参与SARS冠状病毒RNA合成的调控以及核衣壳的形成。并且,SARS-CoV N蛋白能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,从而干扰宿主细胞分裂,在生长因子缺乏的情况下诱导细胞凋亡。前期工作发现N蛋白可能在SARS冠状病毒感染过程中起重要作用。为了研究SARS-CoV N蛋白参与炎症反应的分子机理,以全长N蛋白为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选人胎肝cDNA文库时,发现细胞色素P450(CYP4F3A)与SARS-CoV N蛋白相互作用。CYP4F3A是炎症反应过程中重要的调节蛋白,其相互作用很可能与SARS病毒的致病性相关。　　本研究建立了CYP4F3A在体外的酶促反应体系及其动力学常数测定方法,并通过一系列离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、免疫沉淀、免疫印迹以及ELISA证明,SARS-CoV N蛋白与CYP4F3A结合可以抑制CYP4F3A的ω-羟化酶活性,从而抑制炎症因子LTB4的降解。N蛋白在体外抑制CYP4F3A的酶活,使其Km’值从2.5μmol/L变为10.2μmol/L,而加入229E N蛋白后Km’仅变化为4.82μmol/L。我们发现通过尾静脉注射N蛋白在LPS诱导小鼠炎症模型中起促进炎症反应的作用。Silybin是从植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物,具有抑制5-酯氧酶的作用,从而间接阻断了LTB4的合成。当在LPS注射前1h给予药物Silybin,LTB4浓度比未给药组低。说明Silybin可以通过阻断炎症介质的生成来保护LPS诱导产生的急性肺损伤。并且,当肌肉注射表达N蛋白的质粒并腹腔注射LPS的小鼠血清中LTB4水平与对照组相比升高。将质粒与MDP-C(胞壁肽佐剂)一起通过静脉免疫家兔,动物产生显著的过敏样反应。小鼠和家兔肺部及肠道中性粒细胞浸润,部分动物表现为肺水肿,这些症状与SARS临床表现类似。　　本研究为SARS致病机理的进一步研究提供了重要线索。

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缩略词表

第一章前言

1 冠状病毒

2 SARS冠状病毒（SARS-CoV）

3 SARS致病机理与病理学

4细胞色素氧化酶P450

第二章材料与方法

1 菌株、细胞株及质粒

2 缓冲液

3 培养基

4 试剂及试剂盒

5 实验动物

6 主要仪器设备

7 蛋白质电泳所需凝胶的配制

8 转染质粒的制备

9 贴壁细胞的培养与转染

10 免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）与免疫印迹（Immunoblot, IB）

11 谷胱甘肽S转移酶（glutathion S-transferase, GST）融合蛋白的制备

12 体外结合实验

13 白三烯B4的检测

14 CYP4F3A酶促反应动力学常数的测定

15 SARS-CoV N蛋白的纯化

16 HCoV-229E N蛋白的纯化

17 大肠杆菌thyA-营养缺陷型菌株DY330-TI感受态细胞的制备

18 质粒转化

19 病理学研究

20 小鼠淋巴细胞的分离

21 其他

第三章结果

第一部分 蛋白表达和纯化

第二部分 细胞色素P450(CYP4F3A) 酶促反应动力学的研究

第三部分 SARS N蛋白对LPS诱导小鼠急性炎症的影响

第四部分 细胞内表达SARS N 蛋白对动物炎症反应的影响

第四章讨论

1 SARS-CoV N蛋白抑制CYP4F3A的羟化酶活性

3细胞色素P450（CYP450）的基因多态性

4 SARS-CoV特有蛋白质及病毒来源与变异的研究

5 SARS冠状病毒引起急性肺损伤的可能机制

6 后续还应进行的工作

总结

参考文献

致谢

硕士期间主要研究成果