苯并(a)芘致人胚肺成纤维细胞周期动力学改变及其关卡阻滞机制研究

摘要

背景：苯并(a)芘(BaP)通常被作为多环芳烃(PAHs)类物质的代表，也是最早被发现的致癌物，在环境中广泛存在。大量实验和流行病学研究都提示它与人类多种肿瘤的发生有密切关系。BaP在细胞内的代谢受芳香烃受体(AhR)介导，主要经Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶类代谢。BaP代谢产物醌类引起的氧化应激和BPDE-DNA加合物引起的多基因突变被认为是其毒性发挥的关键起始步骤。BaP致痛过程是一个多系统、多途径、多机制的复杂过程。细胞内有一整套复杂信号传导网络的严格调控，确保细胞的增殖、分化、衰老和凋亡在时间和空问上有序的进行。其中细胞周期关卡调控是机体应对外界遗传损伤的重要机制。细胞周期关卡在DNA受到损伤后使细胞周期阻滞于特定的周期时相，为损伤修复提供时间，维护基因组完整性。关卡功能失调导致突变积累和染色体畸变从而可以引起多种疾病，包括癌症。人们对BaP干扰细胞增殖和凋亡的机制进行了大量的研究，但BaP致癌机制远未明确。
　　 目的：本研究以未受外界物理、化学及生物因素影响、具有正常细胞周期调节功能的人胚肺成纤维细胞(HELF)为研究对象，研究较低遗传毒性剂量的BaP对同步化和未同步化HELF细胞的周期动力学的影响，并从细胞周期蛋白降解和关卡调控蛋白激活的角度对其机制进行了探讨，为BaP致癌机理的研究提供新的线索，并为其他化学物的致癌机制研究提供实验模型。
　　 方法：
　　 ⑴通过MTT细胞增殖实验和彗星实验研究BaP致细胞增殖紊乱的规律，以及遗传损伤后发生的细胞内修复，筛选较低细胞毒性和遗传毒性的BaP作用剂量，并确定细胞周期动力学研究的作用方式。
　　 ⑵体外培养细胞恶性转化实验是较好的研究化学物致癌机制的模型，本研究尝试建立BaP恶性转化的HELF细胞模型，研究细胞周期机制在肿瘤引发和形成过程中所起的作用。本研究以20～400μmol/LBaP多次处理HELF细胞，并采取多项指标对BaP转化过程中的细胞进行鉴定。
　　 ⑶以2、10和50μmol/L BaP对处于对数生长期的未同步化的HELF细胞作用4h，分析作用后不同时间细胞周期的分布，并分析BaP对肿瘤细胞系和永生化细胞系周期的影响。
　　 ⑷为避免占细胞比例较多的G1期细胞对其他时相细胞的反应的掩盖，本研究通过血清饥饿法和接触抑制法同步化G0期细胞，分析血清再刺激或传代后细胞周期的动态改变，获得处于各时相的细胞；并以2、10和50μmol/L BaP针对同步于各期的HELF细胞作用，分析周期分布的改变。从细胞周期调控蛋白cyclins、p53、p21、p16、Rb和E2F-1蛋白表达改变的角度对细胞周期进程调控机制和BaP致HELF细胞周期改变的机制进行探讨。
　　 结果：
　　 ①低浓度(0～50μmol/L)BaP(+/-S9)短时间(4h)处理HELF细胞，能够产生较低的细胞毒性和明显的遗传损伤效应。经过20h的修复，未经S9代谢活化的BaP对细胞产生的遗传损伤基本恢复，经过S9代谢活化后产生的遗传损伤虽然修复明显但仍然能被彗星实验灵敏地检出。10μmol/L是BaP毒性最明显的剂量。BaP致DNA损伤后细胞活性抑制最明显的时间段为处理结束12h～24h，48h后细胞活性逐渐恢复。
　　 ②BaP处理后，细胞出现了生长速度加快、生长时限延长(约10代，30天)、细胞核深染、转化灶形成和四倍体核型等部分转化细胞性状，但细胞未能获得锚着非依赖生长能力，端粒酶未激活，未能越过生长极限而获得永生化。
　　 ③BaP处理后12h、24h和36hHELF细胞出现了周期动力学异常，大量细胞阻滞于G1期，但无明显凋亡发生，该G1期阻滞在BaP作用后12h最为明显，36h细胞周期分布有所恢复。BaP处理后引起p53和p21蛋白剂量依赖性的增加，以处理后24h最为明显。
　　 ④10μmol/L BaP对永生化细胞系(VERO、Balb/C3T3和HaCaT)和肿瘤细胞系(Hep-2和A549)细胞周期的影响各异，具有细胞类型特异性。
　　 ⑤血清饥饿和接触抑制均能较好地同步细胞于G0期，血清生长因子再刺激或者传代均能够使细胞较为同步地再进入细胞周期。静止期细胞再进入周期后，cyclins呈现出明显的时序性表达，和细胞周期变化规律一致，而监控蛋白p21和p16均未见改变。
　　 ⑥根据RB蛋白磷酸化的时间和流式细胞术结果，确定细胞G1/S转换点(R点)为血清再刺激后12h左右，之前的细胞处于G1早期；16～20h大量细胞处于S期；再刺激后20～24h大量细胞进入G2期，并以此作为BaP时相性作用的关键时点。
　　 ⑦10μmol/LBaP对处于G0期细胞作用引起G2期之前的周期延迟，对G1期细胞作用引起G1期阻滞，对S期作用引起G2期阻滞，对G2期作用引起G1和G2期的阻滞。BaP针对G1早期作用后Cyclin D明显下降，cyclin B在BaP针对G2期作用后有一定程度的增加。RB蛋白在BaP针对S期作用后蛋白水平明显下降。而p53和p21蛋白在BaP作用的三个时间段均可见表达增加。
　　 结论：
　　 ⑴BaP单因素作用不能转化二倍体人胚肺成纤维细胞，体内致瘤是一个多阶段、复杂的过程。
　　 ⑵BaP对未同步化HELF细胞作用未启动细胞凋亡，而引起p53依赖的，由p21介导的G1期阻滞。
　　 ⑶血清饥饿和接触抑制均能获得较为同步的各时相的HELF细胞。Cyclins时序性表达是HELF细胞周期进程的驱动机制。
　　 ⑷BaP对HELF细胞的毒性具有非细胞周期依赖性，针对不同时相作用，BaP顺序激活了G1和G2两种周期关卡监控机制，并产生相应的周期阻滞效应。
　　 ⑸p53和p21是介导BaP致G1和G2期周期阻滞的关键蛋白，cyclin D降解是G1期阻滞的原因之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分 BaP致HELF细胞增殖紊乱并激活周期关卡调控的研究

第一节 BaP对HELF细胞的细胞毒性和遗传毒性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 BaP对HELF细胞的恶性转化效应研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三节 BaP致未同步化HELF细胞G1期阻滞及其相关机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 BaP遗传损伤致HELF细胞时相特异性关卡阻滞及机制研究

第一节 HELF细胞周期进程受Cyclins时序性表达驱动的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 BaP致HELF细胞时相特异性关卡阻滞及其机制研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

创新点

综述 端粒霉和细胞周期调控研究进展

致谢

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