肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后受者机体代谢、肠道和移植肝结构和功能及长期存活的作用

摘要

第一部分：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后机体代谢的作用 肝移植受者术前均有程度不同的营养不良，原位肝脏移植(OrthotopicLiverTransplantation,OLT)手术创伤重，机体术后处于严重的分解代谢状态，伴有相当程度的代谢紊乱，术后长期处于负氮平衡状态。如何促进机体代谢，尤其是机体合成代谢，减轻受者应激反应，保护重要脏器功能、促进受者顺利康复对临床肝移植有着重要意义。 谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是小肠粘膜及各种快速分化细胞的特异性营养物，在创伤，感染，大手术等应激条件下，机体对谷氨酰胺的需求增加，但Gln单体溶解度低，在水溶液中易形成毒性的焦谷氨酸，临床应用受限。甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)和丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)是两种常用的人工合成的含Gln二肽，溶解度高，能耐受高温消毒，临床应用方便，实验和文献证实小肠存在二肽载体，在肠功能受损的状态下二肽载体仍有较高的转运能力。本实验首次研究肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后机体代谢的作用。 材料与方法: 近交系Lewis大鼠12只作为供者，近交系BN大鼠24只作为受者，实验动物均为SPF级，250-300克。供者随机选用，受者随机分为两组：对照组(丙氨酸组，ALA组)12只：受者术前三天及手术后每天采用灌胃给予丙氨酸0.6g/kg.d，术后连续应用7天。实验组(二肽组，GLN组)12只：受者术前三天及手术后每天采用灌胃给予Gly-Gln0.6g/kg.d，术后连续应用7天。每组6只正常BN大鼠术前第三天分别取材作为每组的正常对照值，每组另6只BN大鼠术前三天禁食，自由饮水(含0.23％复方氯化钠)，在浙江省医科院动物中心SPF级实验室于超净工作台内无菌条件下行原位肝移植术，术后均采用CsA2mg/kg.d，皮下注射7天，术后自由进食水，不使用抗生素。 结论:肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了异基因大鼠肝移植术后血浆、肠粘膜、骨骼肌Gln及蛋白质代谢和肠粘膜GSH代谢。 第二部分：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后肠道组织结构、吸收功能和屏障功能的作用 肝移植受者多为肝硬化病人，术前均有程度不同的营养不良。移植手术目前多采用不经静脉转流的经典原位肝移植，术中无肝期胃肠道淤血45至65分钟或更长时间，小肠粘膜要经历淤血、缺血及再灌注损伤。 如何维护肠粘膜组织结构，促进其吸收功能的恢复，保护其屏障功能，减少术后肠源性感染的发生，进而促进移植肝功能恢复和病人康复，这对肝移植术后处于免疫抑制状态的病人有着重要的意义。 本实验首次研究Gly-Gln对异基因大鼠肝移植术后肠道组织结构、吸收功能和屏障功能的作用。 讨论:肝移植受者术后胃肠道存在不同程度的肿胀和粘膜损伤，肠道吸收功能受损，肠道微生态紊乱，肠粘膜屏障功能破坏，易发生肠腔内细菌及内毒素移位，增加了OLT术后感染甚至多器官功能障碍综合症(MODS)的发生率，并可能对移植肝慢性失功能(Chronicgraftdysfunction，CGD)有一定作用。本研究证实围手术期肠内应用Gly-Gln维护了大鼠肝移植后小肠的组织结构，尤其是超微结构，提高了肠粘膜Na+-K+-ATP酶活性和双糖酶活性，促进了小肠的吸收功能，减少了肠腔细菌易位，调理了肝移植后紊乱的微生态，保护了肠粘膜屏障功能。这可能是由于肠内应用Gly-Gln二肽可以有效地被肠粘膜吸收，并在体内分解，显著改善了肝移植术后血浆、小肠粘膜、骨骼肌中Gln、蛋白质的代谢，通过直接的肠粘膜营养作用和GSH抗氧化损伤作用，并间接的调整了肠道微生态，进而维护了肠粘膜的组织结构，促进了小肠吸收功能和屏障功能的康复。 结论:肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了异基因大鼠肝移植后肠粘膜组织结构、吸收功能和屏障功能，调理了肠道微生态。 第三部分：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后移植肝代谢、结构和功能的作用 肝移植过程中移植肝脏不可避免的遭受缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury，I/RI)，术后使用免疫抑制剂又可能造成肝脏毒性，加之肠腔细菌易位，胆道功能紊乱，这些因素与肝移植术后的诸多并发症均相关，严重者导致原发性移植肝无功能(PNF)。 材料与方法:实验动物、随机分组、围手术期处理，实验取材均参照研究一，每只大鼠均测定：血浆GSH、门静脉血中内毒素，移植肝组织丙二醛(MDA)含量和蛋白质含量、GSH-PX的活性、肝脏酶谱变化，肝脏常规和超微病理结构。 结果:术后第8天两组受者大鼠肝脏常规和超微病理结构较术前第三天变差，两组移植肝组织MDA含量，肝脏酶谱、门静脉血中内毒素均较术前第三天明显升高，术后第8天GLN组血浆GSH、移植肝组织蛋白质含量、GSH-PX活性均显著高于ALA组。但GLN组门静脉血中内毒素、肝脏酶谱显著低于同期ALA组。常规病理结构显示术后第8天肝脏表现为小胆管增生、炎细胞浸润等损伤表现，GLN组好于ALA组，超微结构显示GLN组内质网丰富，线粒体无肿胀，明显好于ALA组。 在肝移植外科手术中，无肝期将导致下面损伤：(1)门静脉淤血和缺血，(2)动脉及淤滞门静脉血的再灌注损伤，而再灌注过程将同时导致移植肝的损伤。本实验中Gln组术后第8天门静脉血中内毒素显著下降，与研究二GLN组肝、脾、肠系膜淋巴结、肾脏细菌培养数量显著减少是一致的。说明肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善异基因大鼠肝移植后肠粘膜组织结构、吸收功能和屏障功能，调理肠道微生态可能是改善移植肝代谢、组织结构和功能的重要机制。 结论:肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了异基因大鼠肝移植后移植肝代谢、组织结构和功能。 第四部分：肠内长期应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后免疫抑制状态下长期生存的研究 过去十年中，实体器官移植取得了巨大进展，在许多发达移植中心肝移植后受者1年生存率已达到90％。现在对于受者来说，获得长期良好的生存质量是最重要的目。慢性移植物失功是指移植物功能缓慢和不可逆性减退，以往称为慢性排斥反应、晚期移植物失功、晚期移植物丢失。美国UNOS(unitednetworkoforganshare)公布的全球临床器官移植长期存活结果显示，在规范化长期免疫抑制剂治疗下，仍有30％～70％的移植器官在5年内不明原因地发生慢性移植物失功而致病人死亡或需再次移植。 本研究以SPF级异基因大鼠肝移植模型为基础，肝移植后长期使用CsA，研究缺血再灌注损伤、肠粘膜屏障功能、肠道微生态、细菌易位、术后代谢、免疫抑制剂的毒副作用等因素对移植物长期有功能存活的的关系，并探讨长期肠内应用Gly-Gln对移植肝长期有功能存活的影响和探讨与慢性移植物失功的关系。 材料与方法:近交系雄性LEWrat(RT11)大鼠24只作为供者，近交系雄性BN(RT1n)24只大鼠作为受者。 结果:对照组(ALA组)大鼠死亡原因统计包括：肝叶坏死2只，腹腔感染2只，胆道慢性梗阻及增生性病变4只。实验组(GLN组)大鼠死亡原因统计包括：肝叶坏死2只，腹腔感染1只，胆道慢性梗阻及慢性增生性病变2只，采用Kaplan-Meier方法进行生存曲线分析，GLN组明显好于ALA组。 讨论:此研究中心内容在于揭示缺血再灌注损伤、肠粘膜屏障功能、肠道微生态、细菌易位、术后代谢、免疫抑制剂的毒副作用等非特异性免疫和非免疫因素对移植物长期有功能存活的影响，采用Kaplan-Meier的方法分析生存曲线，大鼠死亡原因包括：肝叶坏死、腹腔感染、胆道慢性梗阻及增生性病变，分别代表了肝移植后的重要病理变化，肝脏缺血再灌注损伤引发的肝叶坏死、肠道细菌易位引发的腹腔感染、胆道的并发症和慢性炎性反应性改变引发的胆道慢性梗阻及慢性增生性病变和肝功能衰竭。采用Kamada模型，大鼠肝移植后因未吻合肝动脉胆道失去了血液供给，并且缺少神经支配，采用放置胆管支架管的胆管吻合方式，胆管内易形成胆泥和结石，造成不全性梗阻，在隐性感染的基础上容易发生细菌和内毒素移位、微生态失衡的产物进入肝脏侵蚀移植物，引起胆道慢性梗阻及慢性增生性病变，导致肝硬化和肝功能衰竭，胆道慢性梗阻增生性病变可能是大鼠肝移植后移植肝慢性失功的一种重要类型。长期肠内应用Gly-Gln二肽可能通过直接促进了移植肝脏合成代谢和抗氧化损伤及通过改善肝移植后肠粘膜组织结构、吸收功能和屏障功能，调理肠道微生态而间接改善移植肝代谢、结构和功能而促进移植物长期有功能存活。目前这一领域上缺乏相关研究文献，这一方面还需要深入研究。 结论:1.长期肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽显著改善了异基因大鼠肝移植后免疫抑制状态下的长期生存。 2.长期肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽可能减少了因为感染和胆道慢性梗阻增生性病变引发的移植肝慢性失功?这方面尚需深入研究。

目录

研究一：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后机体代谢的作用

研究二：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善异基因大鼠肝移植后肠道组织结构、吸收功能和屏障功能

前言

1:材料

2：实验分组和标本的采集

3：检测指标及方法；

4：结果

讨论：

参考文献

研究三：肠内应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后移植肝代谢、结构和功能的作用

研究四：肠内长期应用甘氨酰谷氨酰胺二肽对异基因大鼠肝移植后免疫抑制状态下长期生存的作用研究

综述：移植肝脏慢性失功能的研究进展

致谢：