雷帕霉素对大鼠骨髓来源树突细胞免疫表型和细胞因子分泌影响的体外研究

摘要

树突状细胞能够激活初始T淋巴细胞，在器官移植的免疫反应启动和调节中起着关键性作用。树突状细胞启动和调节免疫反应的过程中细胞表面分子诸如MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86、CD54和OX-62等的表达以及细胞因子分泌的变化，会引起不同的免疫反应。树突状细胞表面分子及其细胞因子分泌变化在其发挥免疫作用中起着重要作用，因为不成熟树突细胞往往引起免疫耐受，而成熟的树突细胞则引起免疫应答。在树突细胞成熟的过程中，上述细胞表面分子表达及其细胞因子分泌也会发生相应变化。 基于树突状细胞独特的功能，对树突状细胞生理功能的研究一直以来都是免疫学界关注的焦点。免疫抑制药物大大的改善了器官移植术后病人治疗效果，因此免疫抑制剂对树突细胞生理功能的调控在免疫反应中的作用近年来成了科学工作者新的关注热点。雷帕霉素作为一种免疫抑制剂已经被广泛应用于器官移植领域，起初，雷帕霉素仅作为一种具有强大抗菌作用的抗菌药物，后续的研究发现其在动物移植模型中显示出了强大的抗排斥作用，后来相关机构批准其用于临床肾移植病人。由于雷帕霉素药理作用机制比较独特，副作用较少，而且和其它免疫抑制剂联合应用具有协同作用，对其具体作用机制引起广泛关注。研究表明它对T、B淋巴细胞有强大的免疫抑制作用，然而其对树突细胞功能的影响及其作用机制却鲜见文献报道。在本课题中，我们从大鼠骨髓里面提取出树突细胞前体细胞，在培养基里隔日半定量换液培养，选择合适的时机加入雷帕霉素，然后分别采用流式细胞技术和酶联免疫吸附实验方法观察雷帕霉素对树突细胞免疫表型和细胞因子分泌的影响。这些研究结果对于理解树突细胞的生理功能、作用机制并为后续的移植临床研究打下一定的基础。 目的: 检测雷帕霉素对树突细胞免疫表型和细胞因子分泌水平的影响，从而为研究树突状细胞生理功能，并为后续的树突细胞回输到动物移植模型的研究提供实验数据。 方法: 取SD大鼠股骨和胫骨，无菌条件下冲洗出树突细胞前体细胞，所得的细胞在含10％胎牛血清，GM-CSF(10ng／ml)和IL-4(5ng／ml)的RPMI1640培养基中进行培养，采取隔日半定量换液的方法，并加入相同浓度GM-CSF、IL-4，培养期间用倒置相差显微镜动态观察每组DC的形态。培养过程中第4天给处理组细胞加入雷帕霉素lug/ml，对照组不做任何处理。第6天对照组和处理组加入12S(1μg／ml)刺激树突细胞成熟。24 h后收集细胞培养上清液检测并比较对照组和处理组间TNF-α、IL-10、IL-12和IL-6的分泌水平。收集细胞用流式细胞仪检测并比较树突细胞处理组和对照组之间表面MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86、CD54和OX-62的表达差异。 结果: 一、雷帕霉素对DC细胞因子分泌水平的影响 收集培养七天的细胞培养上清液，运用酶联免疫吸附实验方法检测处理组和对照组的细胞因子分泌量。实验数据表明树突细胞细胞因子TNF-α、IL-10相对分泌量较少，而IL-12p40分泌较多。在本次研究中，由于IL-6分泌量极少以至于没有检测出其含量。经过雷帕霉素的预处理后，细胞因子TNF-α、IL-10和工IL-12p40分泌均有所下降。 二、雷帕霉素对DC免疫表型的影响 收集培养七天的处理组和对照组树突细胞，运用流式技术检测其细胞表面分子的表达，结果表明雷帕霉素处理组和对照组表面细胞分子的表达水平呈现明显的差异。经过雷帕霉素处理后的树突状细胞表面分子CD54、CD40和OX-62表达降低，而CD80、CD86和MHC Ⅱ分子的表达明显升高。 结论: 经过雷帕霉素预先作用的树突细胞其细胞因子IL-10、TNF-α和IL-12p40的分泌减少，细胞表面分子CD54、CD40和OX-62表达降低，而CD80、CD86和MHC Ⅱ分子的表达明显升高，这充分说明雷帕霉素可以通过影响树突细胞表面分子免疫表型和细胞因子的分泌水平而影响DC的功能。

目录

论文说明：中英文缩略语表

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述一　肝移植病人免疫耐受检测方法研究进展

综述二 肝脏树突细胞对肝移植影响的研究

致谢