褐飞虱flightin和TnC4基因初步分析

摘要

褐飞虱是我国水稻上最重要的害虫之一，具有翅二型性。Flightin和TroponinC4(TnC4)都是昆虫肌肉组成相关蛋白，其中flightin最初是在果蝇间接飞行肌（indirect flight muscle，IFM）上被发现，它与肌浆球蛋白(myosin)紧密结合，指导粗肌丝的正确组装，对肌肉伸展活性具有重要作用。TnC4是TroponinC的一种亚型，专门与Ca2+结合，促进肌动蛋白和肌球蛋白互作，从而使肌肉发生收缩。这两种蛋白对维持肌肉的结构和功能起到了重要的作用，但其在褐飞虱长、短翅间的表达差异和功能并不清楚。本研究以褐飞虱cDNA为模板，通过PCR和3’RACE克隆得到褐飞flightin基因ORF，长度为630bp，可编码含209个氨基酸残基的蛋白，预测分子量为25.49kDa;同时克隆了TnC4基因，ORF为459bp，可编码含152个氨基酸残基的多肽，预测分子量17.42kDa。氨基酸同源性比对发现，flightin相对保守，TnC4高度保守，且在N末端保守区域有1个Ca2+结合位点。通过原核表达ightin和TnC4基因，回收蛋白分别制备了2个蛋白的多克隆抗体。我们利用RT-PCR、western blot等技术发现flightin和TnC4在长翅褐飞虱中表达量明显大于短翅中的表达量，且二者都从成虫期开始表达，主要位于胸部组织中。免疫荧光定位实验进一步表明，flightin和TnC4仅存在于胸部IFM组织中。通过显微注射的方法对3龄褐飞虱进行RNA interference（RNAi），flightin和TnC4在mRNA水平上表达明显下调。褐飞虱被干扰后进行飞行测试，其飞行能力基本丧失。本论文验证了flightin和TnC4在长、短翅褐飞虱体内的表达差异，为研究褐飞虱翅肌发育和翅型分化打下了基础。同时，利用RNAi技术成功干扰相关基因表达，使褐飞虱丧失飞行能力，这对褐飞虱迁飞研究和防治都将具有潜在价值。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 褐飞虱翅型分化研究进展

1．2 昆虫肌肉相关的两种蛋白

第2章 褐飞虱flightin、Troponin C4(TnC4)基因的克隆及序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 3'FULL RACE

2．2．2 flightin和TnC4测序结果及分析

2．2．3 flightin ORF全长克隆

2．2．4 TnC4 ORF全长克隆

2．2．5 flightin和TnC4序列同源性分析

2．3 讨论

第3章 褐飞虱flightin和TnC4原核表达及多克隆抗体制备

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 原核表达载体构建

3．2．2 小量表达

3．2．3 蛋白浓度测定

3．2．4 表达产物Western blot鉴定及多克隆抗体的制备

3．3 讨论

第4章 flightin和TnC4在长、短翅褐飞虱体内的表达差异

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果和分析

4．2．1 flightin和TnC4在长、短翅褐飞虱中的表达差异

4．2．2 flightin和TnC4在褐飞虱不同发育时期的表达时相

4．2．3 flightin和TnC4在褐飞虱不同组织中的表达差异

4．2．4 免疫荧光定位

4．3 讨论

第5章 褐飞虱flightin和TnC4基因的RNAi

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果和分析

5．2．1 dsflightin和dsTnC4的干扰效果

5．2．2 飞行测试结果

5．3 讨论

总结

参考文献

在读期间发表的论文

致谢