产KPC酶肺炎克雷伯菌分子流行和质粒介导的KPC酶传播机制研究

摘要

最近十年，产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌成为”超级耐药”细菌并迅速传遍全球，史无前例.2009年报道的来自印度NDA-1金属酶、2004报道的土耳其OXA-48 D类酶以及2001年报道美国产生的A类KPC酶均分离自肺炎克雷伯菌，在短期内均造成多地区的广泛播散。同时，肺炎克雷伯菌是耐药质粒的“收藏家”，不仅增加自身的生存能力，而且还可以将耐药质粒传播给其他菌种，造成耐药基因的播散。自2007中国首次报道产KPC酶肺炎克雷伯菌后，已在局部地区造成流行。本论文主要目的是研究产KPC酶肺炎克雷伯菌在中国的流行状况及质粒介导的KPC酶基因传播。
　　 本研究于2010年在全国20个省市的61家医院收集2971株非重复的肺炎克雷伯菌，并选择20种常见抗菌药物开展体外药物敏感性试验。对碳青霉烯类抗生素耐药或中介的肺炎克雷伯菌进行KPC型碳青霉烯酶检测。改良Hodge确认试验和KPC基因特异引物PCR扩增及测序用于细菌产KPC酶的确定。采用多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分型技术对产KPC酶肺炎克雷伯菌进行同源性分析。
　　 体外药物敏感性试验结果显示，2971株肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美洛培南和厄他培南的耐药率分别为1.3％、1.9％和2.7％。肺炎克雷伯菌产ESBLs的检出率为41.9％。75株碳青霉烯类抗生素耐药或中介的肺炎克雷伯菌中有28株改良 Hodge试验阳性，KPC扩增和测序发现有25株KPC-2基因阳性。产KPC-2酶肺炎克雷伯菌主要来自浙江省（20株），并在北京、辽宁、湖北、上海和江苏各检测到1株。2010年中国多地区产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的检出率0.84％。
　　 25株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌MLST分型检测发现，有17株为ST11，占68％;4株为ST494，4株为未知型，属于新的ST型。北京、辽宁、湖北、上海和江苏菌株均为ST11。4株肺炎克雷伯菌ST494来自浙江的同一家医院。
　　 本课题同时对来源于湖北一家省级儿童医院分离的4株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌进行研究。采用PCR扩增及测序检测β内酰胺酶基因、MLST和脉冲场凝脉电泳(PFGE)技术进行细菌同源性分析，应用质粒PFGE、接合及转化试验、质粒抽提、Southern杂交等技术进行质粒分析及β-内酰胺酶基因在质粒中的定位。
　　 同源性分析显示4株肺炎克雷伯菌PFGE图谱条带及数量相同，MLST分型均力ST439，提示4株细菌为同一克隆。质粒图谱结果表明4株细菌携带的质粒大小在30到300kb这间，KPC-2基因位于30kb大小的质粒上，IMP-4基因定位于300kb质粒，CTX-M-15基因位于80kb大小的质粒上，DHA-1基因分别位于80kb和300kb的2个质粒上。本研究证实在肺炎克雷伯菌中同时产生A类碳青霉烯酶(KPC-2)、金属碳青霉烯酶(IMP-4)、超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-15)和质粒介导的AmpC酶(DHA-1)。
　　 本课题还对分离自同一病人的1株嗜水气单胞菌、2株大肠埃希菌和2株产气肠杆菌进行药敏试验、质粒消除、PCR步移、质粒分析等分子生物学技术研究，明确编码KPC基因在不同质粒中的定位及携带KPC基因的转座子结构。
　　 结果发现5株临床分离细菌均显示对亚胺培南、美洛培南和厄他培南高水平耐药，MIC值均＞32 mg/L。通过质粒消除试验，嗜水气单胞菌含KPC基因的质粒被去除后，细菌对亚胺培南、美洛培南和厄他培南MIC值明显降低。
　　 PCR扩增及测序证实在2株产气肠杆菌均含有blaKPC-2，blaTEM-1，blaSHV-12和blaDHA-1，而它们的接合子中只含blaKPC-2和blaTEM-1。2株大肠埃希菌中检测到blaKPC-2和blaSHV-12，而它们的转化子或接合子中只检测到blaKPC-2。临床分离的嗜水气单胞菌和它的接合子只含blaKPC-2，而质粒消除的嗜水气单胞菌blaKPC-2检测阴性。
　　 质粒电泳图谱分析发现所有5株临床细菌都含有3-5个大小不等的质粒。分子杂交表明KPC基因位于嗜水气单胞菌和大肠埃希菌的30kb可接合或转化的质粒上，而2株产气肠杆菌携带KPC基因的质粒大小不同，分别为200kb和170kb左右。对嗜水气单胞菌转化子进行PCR步移法及测序获得一个11467bp核苷酸片段，结构依次为Tn3的转座酶和解旋酶、部分缺失的TEM、ISKpn8、KPC-2、ISKpr6-like、 KorC、KlcA和有缺失的起始复制蛋白基因。该结构同时还在其他4株细菌中检测到。
　　 本研究首次在气单胞菌属细菌中检测到KPC-2型碳青霉烯酶，并发现不同菌种细菌携带相同的质粒，包含KPC-2基因的相同转座子结构出现在不同菌种的不同质粒上。

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论文说明

致谢

摘要

缩写、符号清单、术语表

前言

第一部分：中国多地区产KPC酶肺炎克雷伯菌

引言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分：质粒介导的同时产KPC和IMP酶肺炎克雷伯菌

引言

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 研究方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第三部分：质粒介导产KPC碳青霉烯酶嗜水气单胞菌的研究

引言

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 研究方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

文献综述

作者简历及在读期间所取得的科研成果