球孢白僵菌脯氨酸脱氢酶的生物学功能及多蛋白桥联因子1介导菌体氧化耐受力的初步机制

摘要

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是丝孢类害虫生物防治真菌，寄主范围极广，因而已被开发成多种制剂用于害虫生物防治。本文主要研究了球孢白僵菌脯氨酸脱氢酶BbPDH在真菌生长发育中的功能。同时还对多蛋白桥联因子1(BbMBF1)调节的抗氧化路径进行了探究。
　　球孢白僵菌BbPDH功能研究首先，构建单基因敲除株和回补株，并以此为基础开展表型实验和生化分析。绿色荧光蛋白和MitoTraker荧光染料共定位分析显示，BbPDH蛋白在细胞内是定位在线粒体上的。BbPDH调控球孢白僵菌生长发育和对热胁迫的应激响应。基因敲除后，除了△BbPDH2，其他的三个敲除菌株在萨氏培养基SDAY和察氏培养基CZA板上的生长都受到了抑制。更换氮源后，这三个敲除株还是表现出生长缺陷。当用NH4Cl作为氮源，TCA循环中α-酮戊二酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸分别作为碳源时，△BbPDH1和△BbPDH4有恢复生长的趋势。而△BbPDH3的生长速率相对野生株来说还是下降的。热激后，野生株、△BbPDH2和△BbPDH3菌株的生长速率分别下降了11.17％、11.83％和19.61％。但是△BbPDH1和△BbPDH4对热胁迫更为敏感。分生孢子产量测定结果显示△BbPDH2和△BbPDH3的分生孢子产量与野生株相比并无显著差异，但△BbPDH1和△BbPDH4由于生长速率变慢，产孢量会有一定程度的下降。△BbPDH1、△BbPDH2和△BbPDH3的芽孢产量和野生株相比并无明显差异，而△BbPDH4芽孢产量下降明显。除△BbPDH2菌株芽孢大小没有明显改变，另外三个敲除株的芽生孢子均比野生株大。在萌发板上，各敲除株分生孢子活力均没受到明显影响。但在水琼脂糖板上，△BbPDH1和△BbPDH4的孢子萌发率相对野生株显著下降，△BbPDH3次之，△BbPDH2孢子萌发率与野生株相近。在对大蜡螟幼虫的生测实验中，除△BbPDH2，其他三个基因敲除株的毒力均呈显著下降。由此可见，球孢白僵菌四个BbPDH基因在菌株生长，耐热及致病力方面发挥着不同的作用。
　　BbMBF1对球孢白僵菌抗氧化路径的调控多蛋白桥联因子1(BbMBF1)，是一个进化上高度保守的转录辅因子，在真核生物发育和抗逆方面扮演着重要角色。我们已经证实，△BbMBF1在甲萘醌胁迫下生长速率变缓，RT-PCR分析在氧化胁迫条件下野生株中该基因的表达量升高。为了进一步探索BbMBF1在甲萘醌胁迫下调节的下游靶标基因，我们比较了野生株和△BbMBF1的转录组。分析显示，BbMBF1调节的氧化响应基因在功能类上主要富集在代谢，细胞营救和运输方面。更重要的是，生物信息分析预测了一个假定的基序，主要分布在与代谢和解毒相关的基因的启动子上。为了获得与BbMBF1p特异性结合的转录因子，我们以提取的细胞核蛋白为样品，进行免疫共沉淀实验，洗脱下来的蛋白通过质谱分析，找到了转录因子BbAP-1。通过构建基因敲除菌株，发现与野生株相比，敲除株在甲萘醌胁迫下生长同样受到抑制。综上所述，这些结果表明球孢白僵菌的BbMBF1通过介导调节代谢和解毒路径的潜在转录因子响应氧化胁迫，为分子手段改造昆虫病原真菌提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第1章 文献综述

1．1 球孢白僵菌研究现状

1．2 真菌中脯氨酸脱氢酶的研究现状

1．2．1 脯氨酸的生物学功能

1．2．2 脯氨酸的吸收和转运

1．2．3 脯氨酸代谢和功能

1．3 丝状真菌中MBF的研究现状

1．4 研究目的和意义

第2章 鉴定四个脯氨酸脱氢酶在球孢白僵菌中的功能

2．1 材料

2．1．1 菌株及培养条件

2．1．2 试剂及试剂盒

2．2 方法

2．2．1 真菌核酸提取

2．2．2 球孢白僵菌脯氨酸脱氢酶基因克隆、序列分析及其胞内定位

2．2．3 PDH家族单基因敲除／回补菌株的构建与鉴定

2．2．4 表型分析

2．2．5 真菌毒力测定

2．3 实验结果

2．3．1 球孢白僵菌与其他真菌中PDH同源蛋白的比较

2．3．2 球孢白僵菌BbPDH1～4p细胞定位及其缺失菌株构建

2．3．4 基因敲除对菌株分生孢子和芽生孢子产生的影响

2．3．5 基因敲除对孢子活力的影响

2．3．6 毒力测定

2．4 结果讨论

第3章 BbMBF1参与调控抗氧化路径的功能研究

3．1 材料

3．1．1 菌株和培养条件

3．1．2 试剂和试剂盒

3．2 实验方法

3．2．1 氧化胁迫下菌株生长速事测定

3．2．2 qRT-PCR分析BbMBF1在胁迫下的表达情况

3．2．3 BbMBF1调节的基因表达RNA-seq分析

3．2．4 潜在的转录因子结合位点的生物信息学分析

3．2．5 与BbMBF1p互作的转录因子的获得

3．2．6 表型验证

3．3 实验结果

3．3．1 BbMBF1在真菌对甲萘醌胁迫的响应中发挥作用

3．3．2 通过RNA测序进行整体表达分析

3．3．3 一个假定的转录因子结合元件的鉴定

3．3．4 质谱分析与BbMBF1p互作的潜在转录因子

3．3．5 BbAP-1参与球孢白僵菌对氧化胁迫的响应

3．4 结果讨论

结语

参考文献

Summary

附录：攻读硕士学位期间的主要成果