天山雪莲花青素生物合成关键酶基因的克隆及功能鉴定

摘要

天山雪莲(Saussurea involucrate Kar.et Kir.)为新疆特有的珍稀植物,特殊的生长环境造就了其独特的药用价值。天山雪莲花青素为黄酮类物质,是其重要的药效成分之一,有限的雪莲资源无法满足市场需求。因此利用现代分子生物学技术,从天山雪莲中分离克隆花青素生物合成相关基因,运用农杆菌介导的遗传转化法将与花青素合成相关的DFR和3GT基因转化进入天山雪莲愈伤组织内,通过离体细胞悬浮培养获得高产黄酮的天山雪莲细胞系,来保障新疆濒危物种资源的可持续开发利用,对天山雪莲花青素新产品的开发具有重要的应用价值。主要研究结果如下:
　　1.天山雪莲花青素生物合成关键酶基因的克隆与序列分析
　　二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)和UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)是植物重要的次生代谢产物花青素生物合成途径中的关键酶。运用RT-PCR和RACE技术从天山雪莲中克隆得到DFR基因(GenBank登录号为JN092126)和3GT基因(GenBank登录号为JN092127)。DFR基因的cDNA全长序列含有1个1029 bp的开放阅读框(ORF),编码343个氨基酸,该基因水母雪莲DFR基因高度同源,相似性达到97％;3GT基因的cDNA全长序列含有1个1548 bp的开放阅读框(ORF),编码516个氨基酸,该基因推断的蛋白序列与草莓GT6蛋白序列的相似性为91％,与毛杨梅3GT的相似性为89％;半定量PCR的结果显示,天山雪莲DFR基因和3GT基因在叶及愈伤组织中表达量最高,在根中有少量表达,茎中不表达。
　　2.天山雪莲遗传转化体系的建立
　　通过研究不同浓度的卡那霉素(kan)、潮霉素(hyg)、羧苄青霉素(car)对天山雪莲愈伤组织诱导、生长及分化的影响,以确定在农杆菌介导的遗传转化中筛选剂和抑菌剂的最适浓度。结果表明:40 mg/L的卡那霉素已经表现出对天山雪莲愈伤组织生长的抑制,当卡那霉素为50 mg/L时,愈伤组织的生长基本停止;8.0 mg/L的潮霉素能够有效抑制天山雪莲愈伤组织的生长,当潮霉素浓度为20 mg/L时表现为生长的愈伤组织块较小、褐化、甚至死亡。同时,低浓度(0.5-2.0 mg/L)的潮霉素可以提高雪莲愈伤组织的分化率;羧苄青霉素作为农杆菌抑菌剂,不同浓度的羧苄霉素对雪莲愈伤组织生长的影响差异极显著,当羧苄霉素的浓度超过400 mg/L时对雪莲愈伤组织的出愈及生长均有明显的抑制作用。分别构建了含有CaMV35S启动子的雪莲DFR基因和3GT基因的植物表达载体pMON530-DFR和pCAMBIA1305.1-3GT。经农杆菌转化实验分析得出10 min为最佳的转化时间,当菌液浓度比值为1:1时对愈伤组织出愈及生长的影响最小。
　　3.天山雪莲DFR基因及3GT基因的遗传转化
　　通过农杆菌叶盘转化法,将天山雪莲DFR基因和3GT基因分别及共同转化进入天山雪莲愈伤组织中,经卡那霉素和潮霉素的筛选,获得了抗性愈伤组织。经PCR检测单转DFR基因的转化率为12.67％,单转3GT基因的转化率为9.33％,共转以上两个基因的转化率为2.63％,将转基因愈伤组织悬浮培养后,用紫外分光光度法检测其总黄酮含量,单转DFR基因愈伤组织总黄酮含量的平均值是非转基因的1.86倍,单转3GT基因是非转基因的2.06倍,共转两个基因是非专基因的3.61倍。本研究为提高天山雪莲黄酮类物质的含量方面的研究奠定了基础。

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1 文献综述

1.1 天山雪莲研究现状

1.2 花青素合成相关基因研究现状

1.3 农杆菌介导的转化法

1.4 研究目的及意义

2 天山雪莲花青素合成关键酶基因的克隆与分析

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 天山雪莲 DFR 和 3GT 基因表达载体的构建

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 天山雪莲遗传转化体系的建立

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 天山雪莲 DFR 和 3GT 基因功能的初步鉴定

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

全文小结与展望

参考文献

在读期间发表的论文

致谢