LuxS基因缺失对变异链球菌生物学性状、生物被膜结构的影响

摘要

目的:本实验是通过采用常规生化鉴定、革兰氏染色涂片鉴定和生长曲线测定等方法阐述了变链菌标准株与LuxS基因突变株在生物学性状方面的异同。此外,建立LuxS基因缺失突变株的生物被膜体外模型,用结晶紫染色等方法观察变链菌生物被膜结构,研究LuxS基因突变对其形成生物被膜的能力的影响,并借助于扫描电镜观察了LuxS基因缺失突变株和标准株所形成的生物被膜,为进一步研究LuxS信号系统对变链菌致龋毒力的调控机制奠定基础。
　　 方法:将变链菌标准株与LuxS突变株分别在含红霉素及不含红霉素的TSA固体培养基中作菌落培养,观察两种菌落的生长情况并作常规生化检测、革兰氏染色涂片以比较两种菌株的生长特性。将复苏24h的标准株及LuxS突变株于紫外分光光度计600nm处制备成吸光度A=1.0的菌悬液备用。将上述菌悬液1000倍稀释接种于BHI液体培养基,置于37℃恒温摇床中孵育,定时取样测量A值,观察比较两者在生长曲线上的差异。将LuxS基因突变株和标准株接种于BHI液体培养基中,培养48h后,取出相应的微孔板,结晶紫染色生物被膜,观察细菌生物被膜的形态变化。将提前制备好的无菌牙釉质磨片置于6孔细胞培养板中,并依次编号第1-6孔,每孔放置4片,分别取变链菌标准株和LuxS突变株的A600=1.0的菌悬液向每孔中接种1ml(其中第1、4孔接种菌液为标准株,2、3、5、6四孔接种菌液为LuxS突变株),均匀滴至牙釉质磨片表面,静置约2min后向每孔中加入5mlTPY液体培养基(其中第1、2、3孔为含2％葡萄糖的TPY溶液,4、5、6孔为含2％蔗糖的TPY溶液),然后取提前制备好的标准株上清液各500μl加入至3、6两孔。将上述菌液于37℃厌氧条件下培养24h,于扫描电镜下观察在无菌牙釉质磨片上形成的生物被膜,并进行总体评价以对比两种菌株的生物被膜的形成能力。
　　 结果:在含红霉素的TSA-Eymr固体培养基中,标准株基本不能生长,而突变株的生长状况基本正常。在不含红霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,镜下可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。通过对变链菌标准株与LuxS突变株测定生长曲线后发现,两者在生长模式上并无明显差异,只是在进入生长的稳定期后,两者在细菌饱和度上有一定差异,标准株获得了较群体感应基因Luxs的突变株更多的细胞生长。在BHI中标准株和突变株均能够形成生物被膜,但结构存在差异:标准株形成光滑且均匀分布的生物被膜,突变株的生物被膜形态粗糙。于扫描电镜下观,与生长在补充了2％葡萄糖的TPY液体培养基中的变链菌标准株相比,LuxS基因突变株所形成的生物被膜表现型未见明显差异。在补充了2％蔗糖的TPY液体培养基中生长时,LuxS基因突变株所形成的生物被膜的表现型在形态学上与标准株形成的生物被膜有明显的不同,LuxS基因突变株形成较大的团簇状菌落,生成生物被膜的能力下降。结构相对粗糙,呈松散的蜂房状,生物被膜基质间有较大的间隙,而标准株生物被膜呈相对融合的外观,分布更加均衡。当用标准株上清液来弥补突变株时,形成的聚集物要小的多,此时形成的生物被膜结构介于标准株和突变株之间。
　　 结论:本研究通过常规生化鉴定、革兰氏染色涂片鉴定和生长曲线测定等方法证实了变链菌标准株与LuxS突变株在生长特性上有一定的差异性,LuxS基因突变可以抑制变链菌的生长,并阐述了两菌株在生物学性状方面的异同。此外,通过建立LuxS基因缺失突变株的生物被膜体外模型,用结晶紫染色等方法观察了变链菌生物被膜结构,证实了LuXS基因突变对其形成生物被膜的能力有一定影响,扫描电镜下分析,两种菌株均表现出形成生物被膜的能力,但LuxS基因突变株形成生物被膜的能力有所减弱,结构发生改变,标准株能弥补LuxS基因突变株的生物被膜的变化表型,依赖于LuxS的群体感应系统会影响变链菌生物被膜的形成。