肠梗阻导致肠功能障碍的中西医结合实验研究Ⅱ

摘要

本研究分为二部分： 第一部分：肠梗阻导致肠功能障碍中肠上皮、肠免疫屏障及微生态的时相性研究 实验一:家兔可复性肠梗阻造模方式及材料的改良 目的：在前期实验建立的家兔机械性肠梗阻的基础上进行梗阻方式和材料的改良，使模型操作更简便、更经济、效果更稳定。 方法：改用“肠管外压迫”的方式，将输液器部件改造成体外牵拉式锁扣，在末段回肠肠系膜无血管区戳孔，套住肠管，引出切口旁腹壁外。手术1～2天后由体外牵拉锁扣固定，造成该部位肠管的闭塞梗阻。解除梗阻时只需剪断锁扣后抽出装置。同时对体外水囊充注式梗阻装置、塑封钢缆圈套器等方法也进行了尝试。 结果：该方法在造成梗阻的安全性、确切性等方面较原模型更优，避免了原方法所存在的腹腔感染、肠粘连、肠套叠以及肠穿孔等意外情况，并且不存在装置脱落等不稳定因素。 结论：在获得更确切稳定的梗阻效果的基础上，改良后的方法创伤更小、造模周期更短，操作简单且材料经济，是较为理想的可复性机械性完全性肠梗阻模型。 实验二:肠梗阻对小肠上皮细胞的损害及其增殖修复能力的影响 目的：观察急性机械性低位小肠梗阻对于小肠上皮损害程度以及其自身再增殖、修复能力的影响。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H1）、梗阻6h组（H6）、梗阻12h组（H12）、梗阻24h组（H24）、梗阻48h组（H48）、梗阻72h组（H72），每组6只。分别对各组动物血清瓜氨酸水平、生化、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性，以及小肠上皮内杯状细胞形态、数量变化进行检测和观察。 结果：肠梗阻后早期肠上皮细胞存在保护性的增殖加速过程，表现为ODC活性在梗阻后6h开始增高（p<0.001），随着梗阻未解除，损害因素不断加重，ODC活性在梗阻24h下降，至72h甚至低于正常水平。对小肠上皮形态学观察中发现杯状细胞增多趋势，且形态发生时相性改变。以上指标在小肠不同部位发生变化的时相和程度并不一致，回肠较之空肠变化更显著。至梗阻48h-72h阶段，血清瓜氨酸水平低于正常水平（p<0.05）。另外在对生化指标的检测中发现CK发生显著变化较早，相对其它指标较为敏感（24h vs48h-72h）。 结论：①肠梗阻发生后的早期就已经存在上皮的修复，表现为小肠组织ODC活性增高：②另外杯状细胞可能参与了小肠粘膜的修复，并且可能是上皮修复的关键细胞；③在梗阻后期随着上皮增殖活性的降低，血清瓜氨酸水平这一间接指标也随之降低，说明其对判断小肠功能障碍严重程度具有一定参考价值；④在肠梗阻发生后，CK相对其他生化指标可能对肠实质性损害更具有敏感的诊断提示意义。 实验三:小肠梗阻后肠腔内环境及微生态变化 目的：观察急性机械性低位小肠梗阻发生后肠道内环境及微生态的改变，以了解肠梗阻发生后肠道自稳态破坏与肠屏障破坏的时相性关系。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H1）、梗阻6h组（H6）、梗阻12h组（H12）、梗阻24h组（H24）、梗阻48h组（H48）、梗阻72h组（H72），每组6只。观察梗阻后每一时段小肠内PH、含水量及采用平板计数法了解肠杆菌科与双歧杆菌菌群数量变化。另外在不同时段进行血内毒素水平、各脏器细菌移位阳性率等进行观察。 结论：肠梗阻后肠功能障碍是对方面因素的综合结果，其中肠道自稳态的破坏为之后的细菌大量增殖、细菌和内毒素移位提供了环境基础。肠梗阻较早期的12h-24h阶段可能是肠内环境、微生态发生剧烈转变的阶段，同时也可能是细菌和内毒素移位的开始。而此时肠道机械屏障往往并没有出现广泛破坏，这更说明机械屏障、生物屏障、化学屏障的破坏都是肠功能障碍的危险因素。 实验四:肠梗阻对肠上皮Claudin1 mRNA表达的影响 目的：了解急性肠梗阻发生后肠道上皮细胞间紧密连接破坏的时相性特点。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H1）、梗阻6h组（H6）、梗阻12h组（H12）、梗阻24h组（H24）、梗阻48h组（H48）、梗阻72h组（H72），每组6只。利用实时荧光定量RT-PCR技术，对动物末段小肠上皮的紧密连接相关蛋白Claudin1的mRNA表达情况进行相对定量分析。 结论：肠梗阻发生后早期（6h）已经发生机械屏障的破坏，表现为紧密连接蛋白上游基因的低表达，随着梗阻进展，这种低表达更加显著，至梗阻48h-72h阶段，这一基因的表达水平已经很低。提示这一阶段肠上皮的完整性已经完全失去，肠道机械屏障破坏严重。 实验五:肠梗阻家兔小肠免疫屏障功能的变化 目的：利用肠梗阻模型，观察急性机械性肠梗阻的发生对肠道免疫系统的影响。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H1）、梗阻6h组（H6）、梗阻12h组（H12）、梗阻24h组（H24）、梗阻48h组（H48）、梗阻72h组（H72），每组6只。采用流式细胞术对梗阻近端低位回肠、高位空肠两个不同部位小肠派伊尔淋巴结（PP）的CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞亚群进行分析，利用HE染色切片计数上述两个不同部位IEL和LPL的百分比于梗阻不同阶段的变化。另外ELISA法检测小肠内分泌型免疫球蛋白A（S-IgA）含量。 结论：①肠梗阻发生后，小肠PP数量和总面积均增加，这可能与梗阻后受到更多炎性因素刺激有关，另外其内淋巴细胞亚群也出现相应变化，CD3+呈不断增多趋势，CD4+亚群比例、CD4+/CD8+均在早期增多，而后随着梗阻进展逐渐下降。反之，CD8+亚群比例早期降低，后期增高，这些都预示着肠道免疫的一过性增强和之后的减弱；②通过对上皮内IEL、固有层LPL占总细胞数量百分比的统计，可以看出，IEL变化存在一定改变，但本实验尚未发现统计学的差异。而LPL百分比特点也是梗阻早期增大，后期下降，这可能是淋巴细胞归巢至固有层这一效应部位增多有关，后期随着淋巴细胞凋亡增多和其它大量炎性细胞浸润而至其比例下降；③s-IgA的量的变化进一步印证了上述现象，在早期肠腔内增多，至后期逐渐低于正常水平；④肠道免疫系统的激活是较早出现的，而且肠梗阻引发的肠免疫屏障改变可能存在部位上的差异，回肠更早、更强烈的出现免疫改变。而固有层效应部位上淋巴细胞可能这种差异并不明显，有待印证。 第二部分：四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍的调节作用的实验研究 实验六:四君子汤对肠梗阻解除后小肠上皮修复的调理作用 目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻梗阻解除后自然恢复与中药四君子汤对小肠上皮细胞增殖与修复的影响。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组（Sham）、梗阻48模型组（M48）、自然恢复48h组（S48）、中药治疗48h组（T48）、自然恢复96h组（S96）、中药治疗96h组（T96），每组6只。对动物模型梗阻解除后48h、96h时肠杯状细胞形态学、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性、血清瓜氨酸水平、紧密连接相关蛋白Claudin1 mRNA表达等分别进行检测和观察。 结论：①中药四君子汤可以促进肠梗阻解除后肠上皮细胞的再增殖和上皮完整性的修复过程，表现为其可以加速肠上皮内杯状细胞对肠上皮的重建的完成进度；②可以提高小肠组织ODC活性，提示四君子汤能提高上皮再生能力；③而上皮再生后的结果体现为血清瓜氨酸水平的提高；④四君子汤可以上调肠上皮紧密连接相关蛋白Claudin1的上游基因表达，促进肠上皮完整性的修复⑤通过结果说明肠梗阻解除后的肠功能障碍在辨证上存在脾胃虚的情况，邪实已祛，正气受损的实质可能应该包括肠上皮的损害，而四君子汤的作用靶点之一可能是促进肠隐窝干细胞的增殖从而达到上皮完整性的修复。 实验七: 四君子汤对肠梗阻解除后小肠免疫的调理作用 目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻解除后自然恢复及中药四君子汤对肠道免疫屏障的影响。 方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组（Sham）、梗阻48模型组（M48）、自然恢复48h组（S48）、中药治疗48h组（T48）、自然恢复96h组（S96）、中药治疗96h组（T96），每组6只。通过流式细胞术对动物模型梗阻解除后48h、96h时PP淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）进行分析、利用ELISA法对肠道内s-IgA含量进行检测以及通过病理切片对IEL、LPL百分比进行计数。 结论：肠梗阻解除后小肠的免疫屏障功能紊乱并没有立即恢复，自然恢复48h后CD4+、CD4+/CD8+比值等指标并没有随之恢复，而却较M48组更趋下降，这可能提示肠功能的免疫状态并没有因肠梗阻解除而立即恢复，这可能是肠道内环境紊乱、肠道菌群失调以及肠上皮完整性的破坏不可能马上改善有关。而应用四君子汤可以明显促进小肠在梗阻解除之后存在的免疫屏障功能障碍。表现为，四君子汤干预组较自然恢复组的PP淋巴亚群更快恢复正常，并可能对肠效应部位的淋巴细胞分布或数量具有调节作用。肠梗阻解除后的脾胃功能受损的实质可能涵盖了肠上皮功能低下以及肠免疫系统的紊乱，而四君子汤健脾作用的靶点很可能包括对肠道免疫系统的调理作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语表

声明

前 言

第一部分肠梗阻导致肠功能障碍中肠上皮、肠免疫屏障及微生态的时相性研究

实验一 家兔可复性肠梗阻造模方式及材料的改良

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

实验二 肠梗阻对小肠上皮细胞的损害及其增殖修复能力的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验三 肠梗阻发生后肠道内环境及微生态变化

1材料与方法

2结果

3讨论

3.4小结

实验四 肠梗阻对肠上皮claudin1 mRNA表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验五 肠梗阻家兔小肠免疫屏障功能的变化

1材料与方法

2结果

3讨论

3.4小结

第二部分四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍的调节作用的实验研究

论文六 四君子汤对肠梗阻解除后小肠上皮修复的调理作用

1材料与方法

2结果

3讨论

4.小结

论文七 四君子汤对肠梗阻解除后小肠免疫的调理作用

1材料与方法

2结果

3结论

4.小结

结 论

参考文献

攻读学位期间发表专著及论文情况

发表论文1

发表论文2

发表论文3

发表论文4

发表论文5

文献综述

综述一 肠功能障碍评价及检测的基础与临床

综述二 健脾益气中药对肠屏障的保护作用的机理

致 谢

特别致谢