人工伴侣与小分子添加剂协同辅助变性溶菌酶复性的研究

摘要

本文在改进溶菌酶标准曲线测定方法的基础上，优化了人工伴侣辅助溶菌酶复性的各种条件，进一步研究了人工伴侣与小分子添加剂协同辅助高浓度溶菌酶的复性。 应用改进的方法测定了溶菌酶标准酶活数值，通过一组实验得到了任意温度下的标准酶活，增加了实验的准确性和可比性。 考察了人工伴侣辅助溶菌酶复性的各种条件。结果表明，当复性体系中溶菌酶的浓度不同时，得到最大复性收率的GSSG/GSH浓度有所差异。在0.06、0.1、0.2 mg/mL的酶浓度下，随酶带入的还原型DTT的作用可以不予考虑，GSSG/GSH维持在1：1的比值可以得到最大复性收率；在0.6 mg/mL的酶浓度下，应当考虑DTT的作用，此时需将变化后的GSSG/GSH比值维持在1：1，才能得到较大复性收率。当复性体系中酶浓度为0.6 mg/mL、盐酸胍浓度为0.4 mol/L时，在1.2：9.6mmol/L的CTAB/β-CD处可获得最大复性收率。静止和摇动条件对人工伴侣辅助复性有明显影响：在静止环境下，复性需要较长时间，且β-CD量的增加有助于复性收率的提高；在摇动环境下，较短的时间和较低的β-CD浓度就可以达到较高的复性收率，但这个数值要低于静止条件下长时间、高浓度β-CD下的复性收率。 精氨酸、甘油、乙酰胺、硫脲都可以与人工伴侣协同辅助溶菌酶的复性，其中乙酰氨和硫脲的协同作用较好。乙酰氨的协同作用反应较快，在本实验条件下，随乙酰氨浓度的升高，协同作用不断加强；硫脲的协同作用反应较慢，存在最佳协同作用的硫脲浓度。 通过对正交试验结果的分析，可知在0.4 mol/L的盐酸胍存在时，使1 mg/mL溶菌酶达到较好复性收率的协同条件是：乙酰胺2.2 mol/L、GSSG/GSH 5：2mmol/L、CTAB/β-CD 1.2：9.6 mmol/L，复性1h后收率可以达到85％；或者硫脲0.8 mol/L、GSSG/GSH 5：2 mmol/L、CTAB/β-CD 1.2：9.6 mmol/L，复性1h后收率为74％。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1蛋白质复性的研究现状

1.1.1包含体的形成和性质

1.1.2包含体的体内抑制

1.1.3包含体的体外复性

1.2小分子添加剂辅助蛋白质复性

1.2.1小分子添加剂的种类及作用机理

1.2.2小分子添加剂辅助复性的特点

1.3分子伴侣与人工伴侣辅助蛋白质复性

1.3.1分子伴侣与蛋白质复性

1.3.2人工伴侣与蛋白质复性

1.4本论文的研究意义及内容

第二章溶菌酶复性实验条件的优化

2.1溶菌酶标准曲线测定方法的改进

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3实验结果

2.2人工伴侣辅助溶菌酶复性实验条件的优化

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.2.3结果和讨论

2.2.4小结

第三章人工伴侣与小分子添加剂协同辅助溶菌酶复性

3.1实验材料

3.1.1实验试剂

3.1.2实验设备

3.2实验方法

3.3实验结果和讨论

3.3.1人工伴侣与小分子添加剂对复性的协同作用

3.3.2添加剂浓度对0.2 mg/mL酶协同作用的影响

3.3.3添加剂浓度对0.6 mg/mL酶协同作用的影响

3.3.4正交试验对高浓度溶菌酶复性条件的优化

3.4小结

第四章结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致 谢