多年生簇毛麦基因组新重复序列的分离及其在小麦抗病新种质鉴定中的应用

摘要

簇毛麦属(Dasypyrum原作Haynaldia)包括二倍体一年生簇毛麦（D.villosum，染色体组为VV），二倍体多年生簇毛麦(D.breviaristatum，染色体组为VbVb)和四倍体多年生簇毛麦(D.breviaristatum，染色体组为VbVbVbVb)。一年生簇毛麦主要分布在地中海沿岸，而多年生簇毛麦主要分布在西北非的山区，希腊和摩洛哥。在植物分类上属禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）的小麦亚族（Triticinae），是小麦的野生近缘种，具有抗白粉病、抗叶锈病和秆锈、抗全蚀病、分蘖力强、小穗数多、耐旱耐寒、耐盐和蛋白质含量高等许多栽培小麦所需要的优良性状，是小麦高产、抗病、优质育种的重要遗传资源。
　　 迄今为止，对簇毛麦属物种研究仍有如下不足：(1)四倍体多年生簇毛麦在该属中的遗传进化关系一直存在争议。特别是对四倍体多年生簇毛麦与二倍体多年生簇毛麦的染色体组关系研究上，缺乏分子和细胞学证据。(2)可在育种中利用的簇毛麦染色体组（臂）特异分子标记不能满足小麦-簇毛麦新种质鉴定的需求，需要进一步挖掘和开发。(3)我们在开展将四倍体多年生簇毛麦抗白粉和抗条锈基因导入小麦的研究工作中，育成了一批小麦-四倍体多年生簇毛麦抗病渐渗系，但是这些抗病渐渗系中外源染色质的同源群关系尚未明确。(4)涉及二倍体一年生簇毛麦1V、4V和6V染色体的抗病（或高产）易位系已经育成，但是涉及2V、3V、5V和7V染色体的易位系还未见报道。
　　 本文着重解决上述4个问题。本文对四倍体多年生簇毛麦在簇毛麦属的遗传进化关系进行了深入研究；创制并用建立的多个EST-STS标记和PLUG标记鉴定了小麦-四倍体簇毛麦附加系；诱导和鉴定了小麦-二倍体一年生簇毛麦2V、3V、5V和7V补偿性罗伯逊易位系。研究结果如下：
　　 1．簇毛麦属物种的遗传进化关系：(1)利用RAPD技术对二倍体一年生簇毛麦、四倍体多年生簇毛麦和小麦族黑麦、中间偃麦草、拟鹅观草和黑麦等物种进行了聚类分析，结果表明二倍体一年生簇毛麦和四倍体多年生簇毛麦不能聚在一起，表明四倍体多年生簇毛麦不是由二倍体一年生簇毛麦加倍而来。(2)吉姆萨C分带结果显示，四倍体多年生簇毛麦与二倍体多年生簇毛麦具有较多的中间带，这些带纹多属弱带型，并且二者的带型还有所差异；而二倍体一年生簇毛麦具有较多的端带，这些带纹多属强带型。因此，C分带的证据只能粗略证明四倍体多年生簇毛麦与二倍体多年生簇毛麦遗传关系较近，而与二倍体一年生簇毛麦相对较远。(3)克隆了簇毛麦属三物种的叶绿体infA基因和线粒体trnfM及rrn18基因，并以此对这些基因序列分别进行了bootstrap分析。分析结果支持四倍体多年生簇毛麦是由二倍体多年生簇毛麦加倍而来的观点。(4)基因组原位杂交和利用核糖体基因pTa71为探针的原位杂交清楚的表明四倍体多年生簇毛麦是由二倍体多年生簇毛麦加倍产生的。(5)以黑麦基因组重复序列pSc74为探针的原位杂交表明，从二倍体多年生簇毛麦加倍到四倍体多年生簇毛麦的过程中，不仅发生了染色体的重排，还发生了基因组DNA水平上的重组现象。
　　 2．簇毛麦基因组或单染色体分子标记：(1)分离得到簇毛麦基因组1个新的重复序列pDb12H（或称为OPH12），该重复序列和大麦基因组Sabrina反转录重复序列具有95％的同源性。根据pDb12H设计引物，对含簇毛麦染色质的材料和大量对照材料进行扩增，建立了簇毛麦基因组SCAR标记，该标记被用来筛选小麦-四倍体多年生簇毛麦抗病渐渗系和小麦-二倍体一年生簇毛麦易位系。以pDb12H为探针对小麦族大量物种进行原位杂交，结果表明，pDb12H仅分布在小麦族二倍体一年生簇毛麦V基因组、多年生簇毛麦Vb基因组、大麦H基因组和中间偃麦草Js基因组上，即pDb12H高拷贝存在于V基因组，Vb基因组，H基因组和Js基因组上，而寡拷贝存在于小麦族其他基因组上，Southern blot也证实了上述结果。根据FISH和Southern blot结果推测pDb12H在小麦族各基因组(V、Vb、H和JS基因组除外)分化前期可能就失去了转座活性。Kishii等曾用原位杂交和分子标记手段证实百萨偃麦草J基因组和黑麦R基因组参与了中间偃麦草Js基因组的形成，认为中间偃麦草基因组应为StJs(V-J-R)s。本文发现大麦H基因组也参与了中间偃麦草基因组进化，因此我们建议将中间偃麦草基因组暂时补充修订为StJs(V-J-R-H)s。(2)利用小麦第1到第7同源群的943对EST-STS引物对四倍体多年生簇毛麦和中国春进行筛选，PCR产物利用HaeIII、MspI、RsaI和Alul四种酶进行酶切，获得了474个STS标记。同时还筛选了小麦第1到第7同源群的56对PLUG引物，利用TaqI和HaeIII两种酶对PCR产物进行酶切，筛选到6个PLUG标记。
　　 3．小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系的鉴定：利用建立的SCAR分子标记对小麦-四倍体多年生簇毛麦抗病渐渗系进行初步筛选，然后利用C分带对筛选出的渐渗系进行普查，结果显示这批抗病渐渗系中只有2种不同类型的附加系Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4。利用上述筛选到的STS标记和PLUG标记对Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4进行鉴定。首次发现Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4中四倍体簇毛麦染色体均发生了重组。附加系Y93-1-6-1中四倍体簇毛麦染色体长臂为6VbL，其短臂发生了6VbS和7VbS染色体片段的重组；而附加系Y93-1-A6-4中四倍体簇毛麦染色体发生了更为复杂的染色体重组，其短臂为6VbS和7VbS的重组，长臂为1VbL、2vbL和7VbL的重组。
　　 4．小麦-二倍体一年生簇毛麦易位系的创制与鉴定：利用中国春-二倍体一年生簇毛麦附加系与相应的中国春单体进行杂交获得双单体，然后双单体进行自交，对所获得的自交种子进行筛选获得相关易位系。(1)筛选来自双单体40+2V+2D的自交后代660个单株，获得4个杂合T2VL.2DS易位系，3个杂合T2VS.2DL易位系。(2)筛选来自双单体40+3V+3D的自交后代496个单株，获得5个T3DS.3VL易位系，3个杂合T3DL.3VS易位系。(3)筛选来自双单体40+5V+5D的自交后代342个单株，获得12个杂合的T5DL.5VS易位系，未发现T5DS.5VL易位系。(4)筛选来自双单体40+7V+7D的自交后代384个单株，获得6个杂合T7DS.7VL易位系，2个杂合T7DL.7VS易位系。对上述杂合易位系的自交种子进行筛选，目前都已获得了纯合的易位系，这些优异的种质资源可用于小麦育种。
　　 综上，本论文对簇毛麦属种间的进化关系进行了系统研究，对簇毛麦特异分子标记进行了进一步挖掘和开发并利用开发的分子标记对新创制的种质进行了鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 小麦的基因源

1.2 小麦外源物种优异基因向小麦的导入方式

1.3 簇毛麦属物种分类、遗传进化关系及其在小麦抗病育种上的应用现状

1.3.1 簇毛麦属物种分类及其遗传进化关系研究进展

1.3.2 簇毛麦属物种在小麦抗病育种中的应用现状

1.4 小麦背景中外源染色质的检测

1.4.1 形态学标记、细胞学标记和生化标记

1.4.2 分子标记类型及其在小麦辅助育种中的应用

1.4.3 簇毛麦属物种分子标记研究现状

第二章 材料与方法

2.1 材料及来源

2.2 新抗病种质的创制

2.2.1 小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系的获得

2.2.2 小麦-簇毛麦罗伯逊易位系的诱导

2.3 实验方法

2.3.1 DNA提取

2.3.2 PCR(RAPD、SCAR、PLUG和EST)扩增与分析

2.3.3 PCR扩增产物的克隆测序、序列比对和聚类分析

2.3.4 根尖染色体计数观察

2.3.5 染色体C分带

2.3.6 原位杂交

2.3.7 点杂交

2.3.8 抗病性鉴定

第三章 结果与分析

3.1 簇毛麦属物种的遗传进化关系

3.1.1 RAPD聚类分析

3.1.2 多年生簇毛麦标准C带与同属簇毛麦比较

3.1.3 簇毛麦属物种叶绿体和线粒体基因进化关系与分析

3.1.4 GISH及FISH分析

3.1.5 簇毛属三物种遗传进化关系讨论

3.2 簇毛麦基因组或单染色体分子标记

3.2.1 RAPD标记OPH12

3.2.2 RAPD标记转化SCAR标记

3.2.3 讨论

3.3 Sabrina反转重复序列在小麦族物种中的分布与进化

3.3.1 Sabrina反转重复序列在四倍体多年生簇毛麦染色体的定位

3.3.2 Sabrina反转重复序列在小麦族物种中的分布

3.3.3 Sabrina反转重复序列在小麦族物种中的进化讨论

3.4 STS-PCR标记和PLUG标记

3.4.1 STS-PCR标记

3.4.2 PLUG标记

3.5 小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系的创制与鉴定

3.5.1 小麦-四倍体多年生簇毛麦渐渗系的初步筛选

3.5.2 小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系的鉴定

3.5.3 讨论

3.6 小麦-二倍体一年生簇毛麦易位系的创制与鉴定

3.6.1 小麦-二倍体一年生簇毛麦2DL.2V#3S及2DS.2V#3L易位系的鉴定

3.6.2 小麦-二倍体一年生簇毛麦3DL.3V#3S及3DS.3V#3L易位系的鉴定

3.6.3 小麦-二倍体一年生簇毛麦5DL.5V#3S易位系的鉴定

3.6.4 小麦-二倍体一年生簇毛麦7DL.7V#3S和7DS.7V#3L易位系的鉴定

3.7 小麦-簇毛麦易位系和小麦-多年生簇毛麦附加系抗病性鉴定

3.8 讨论

3.8.1 分子标记在小麦-外、源物种易位系的筛选和鉴定中的作用

3.8.2 不同小麦-外源物种易位系创制方法

3.8.3 新型小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系及补偿性小麦-二倍体一年生簇毛麦罗伯逊易位系丰富了抗病育种理论与实践研究

第四章 结论

4.1 簇毛麦属物种的遗传进化关系

4.2 簇毛麦基因组或单染色体分子标记

4.3 小麦-四倍体多年生簇毛麦附加系的鉴定

4.4 小麦-二倍体一年生簇毛麦易位系的创制与鉴定

致谢

参考文献

硕博连读期间已发表和待发表论文