附红细胞体病流行病学及综合防治技术的研究

摘要

本文对附红细胞体(EH)病的检测方法、流行规律、免疫致病机理和药物治疗进行了深入研究，建立了猪、犬EH PCR检测方法，具有高度的特异性和敏感性。较为详细的调查了上海地区猪、犬EH病流行情况，掌握了EH病的流行特点和流行规律，为防控该病提供了科学数据。建立了猪EH小鼠、大鼠跨种间感染动物模型。将人医治疗疟原虫的药物青蒿琥酯和治疗血液疾病药物维甲酸应用到EH的治疗，发现二者均有显著疗效，为防控该病提供了具体方法。具体研究结果如下： 一、附红细胞体实验室检测方法的建立。 通过光镜(鲜血压滴片、瑞氏．姬姆萨染色)、透射电镜及PCR检测方法，观察了猪、犬EH显微、超微结构，扩增了猪、犬EH的特异片段。发现无论是鲜血滴片还是瑞氏．姬姆萨染色涂片，均能清晰得观察到EH的形态结构，但此法易产生假阳性，需要PCR．辅助诊断。电镜技术可以观察EH的超微结构，其结果可以作为诊断依据，但操作复杂。 根据已有猪EH片段设计引物，扩增得到810 bp PCR产物。根据已发表的不同物种EH的16S rRNA序列设计特异性物，在170 bp处扩增得到犬EH目的片段。所建立的猪、犬EH的PCR方法均具有高度的特异性和敏感性，可以作为EH的流行病学调查。同时，对EH显微和超微结构的观察的过程中发现EH通过纤丝附着于红细胞表面，这可能是EH引起红细胞变形、溶血的病理学基础。 二、上海地区EH流行情况调查。分别应用鲜血滴片和PCR方法对上海地区猪、犬EH的流行情况作了初步调查。发现猪EH镜检阳性率为97.77％，PCR检测阳性率为93.06％。不同日龄和性别猪EH感染率无显著差异。但是随着日龄的增高EH感染率有逐渐增加的趋势，雌性猪感染率高于雄性。提示上海区猪群普遍感染EH，感染率较高。 上海地区犬场、诊所和居民家中犬EH感染率高于30％，犬场的感染最高，其次是宠物诊所，居民家中感染率最低。两种检测方法比较结果表明PCR的检测更为准确、灵敏。如此高的EH感染率给公共卫生安全带来了潜在危胁，对EH的综合防控技术进行研究势在必行。 三、人工感染猪EH对小鼠红细胞免疫功能的影响。首先通过腹腔注射攻毒，PCR和电镜检测，建立了猪EH的SPF小鼠感染模型。利用此模型进行红细胞RBC-IC黏附酵母菌花环试验，发现EH感染组的RBC-IC花环率显著下降，表明EH感染降低了机体免疫功能，这可能是EH致病的免疫学基础。 四、注射用青蒿琥酯及维甲酸(X)对EH治疗效果的研究。通过体外药敏试验观察青蒿琥酯、维甲酸、贝尼尔、咪唑苯脲对猪红细胞EH感染率的影响，发现含青蒿琥酯和维甲酸的药物组能够显著降低EH感染率。表明两种药物均可以作为治疗EH的候选药物。在此基础上建立SPF鼠(大鼠、小鼠)EH感染动物模型，用青蒿琥酯、维甲酸、复方磺胺和复方强力霉素治疗EH病猪及人工感染EH的小鼠和大鼠。结果表明，维甲酸(X)疗效显著，而青蒿琥酯需调整到合适的剂量才能发挥药效，说明给药浓度与疗效相关。而复方磺胺和复方强力霉素均无明显疗效。 通过本项研究，建立了猪、犬EH检测方法，包括光镜(鲜血压滴片、瑞氏-姬姆萨染色)、透射电镜及PCR．检测方法，全面系统调查上海地区猪和犬EH病的流行情况，掌握上海地区EH病的流行规律和流行特点，为制定防控EH病有效措施提供了科学依据。在此基础上建立了SPF鼠(大鼠、小鼠)EH感染动物模型，开展EH对红细胞体免疫功能的影响的研究，探索了EH免疫致病机理：开展了药物疗效研究，筛选出了两种高效、安全、特异、无毒副作用的药物，填补了国内外研究的空白，对防止EH在人类大爆发流行作前期的理论与技术储备具有重要意义，为制定EH病综合防制措施提供了理论依据和具体方法。

目录

摘要

第一章文献综述

第一节附红细胞体病研究现状及进展

第二节研究目的意义、总体思路和实验设计

第二章EH实验室检测方法的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

4本章小结

第三章上海地区猪、犬EH病流行情况初步调查

1材料和方法

2结果

3讨论

4本章小结

第四章人工感染猪EH对小鼠红细胞免疫功能的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4本章小结

第五章注射用青蒿琥酯及维甲酸(X)对附红细胞体治疗效果的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4本章小结

文章总结

参考文献

博士后在站期间的工作成果

致谢