假单胞菌株M18中las菌群传感系统的鉴定及抗生素合成的调控研究

摘要

荧光假单胞菌(Pseudomonas sp. M18)是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种,其生防作用部分归功于其分泌的包括藤黄绿脓菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)在内的多个抗生物质。本研究试图在分子水平上鉴定与藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸相关的生物调控因子,揭示和阐明这些调控因子和这两种抗生素生物合成之间的关系。并以这些调控因子为靶向,构建Plt高产工程菌株,提高Plt的产量,增强M18生物防治能力。本研究内容主要包括二个方面:第一方面,本实验室课题组已经构建和鉴定了rhl菌群传感系统,所以预测M18菌株中存在潜在的las菌群传感(Quorum sensing QS)系统。根据假单胞菌株M18兼有荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌的遗传学背景;而且假单胞菌株M18产生的短链高丝氨酸内酯信号分子种类也与铜绿假单胞菌类似。据此设计保守引物扩增得到潜在的lasR和lasI基因,序列分析显示,lasR、lasI基因DNA和所得表达蛋白质序列与铜绿假单胞菌株PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)中报导的las菌群传感系统高度相似。运用同源重组技术,分别构建lasI和lasR基因的染色体失活突变株,与野生型菌株相比,抗生素藤黄绿脓菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)的产量均分别提高了4-5倍和2-3倍。在lasI和lasR突变株的反式互补实验中,两种抗生素的产量回复到野生型水平。pltA’-’lacZ和phzA’-’lacZ翻译融合的测定结果进一步证明lasI和lasR的编码产物对Plt和PCA生物合成基因簇具有负调控作用。las系统正调控细菌的群集运动,在lasI和lasR的失活突变株中,细菌的群集运动能力消失。对lasI和lasR突变株和野生型的生长曲线的研究发现,lasI和lasR基因的编码产物对细菌的生长具有抑制作用。结果表明,las系统作为整体调控因子的编码基因,参与细胞内多种生物活动的调控作用。第二方面,本实验室课题组已经构建了两个高产Plt的突变株,分别是rsmA突变株M18R和rhlI突变株M18IG。为了进一步研究增强M18菌株的生防能力,运用同源重组技术,构建了rsmA rhlI的双突变株M18RIG。与野生型菌株相比,双突变株中抗生素藤黄绿脓菌素(Plt)产量提高了10倍;与两个单突变株M18R和M18IG相比,Plt产量并没有提高很多。在双突变株中,吩嗪-1-唆酸(PCA)产量提高了4倍,在突变株M18R和M18IG中,PCA产量分别降低了70％和90%。pltA’-’lacZ和phzA’-’lacZ翻译融合的测定结果进一步证明rsmA rhlI共同突变对Plt和PCA生物合成基因簇具有负调控作用。对突变株M18R, M18IG,M18RIG和野生型的生长曲线的研究发现,在PPM培养基中,三个突变株的生长状况优于野生型。在β-半乳糖苷酶活性中,发现RsmA负调控rhlI基因的表达。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1.1 假单胞菌简介

1.1.1 病原性假单胞菌

1.1.2 生防假单胞菌

1.1.3 生物降解假单胞菌

1.2 抗生素简介

1.3 假单胞菌生防机制

1.3.1 分泌抗生素

1.3.2 分泌铁载体

1.3.3 根际定殖与竞争

1.3.4 系统抗性的诱导

1.4 菌群传感

1.4.1 菌群传感简介

1.4.2 革兰氏阴性细菌中的菌群传感

1.4.3 革兰氏阳性细菌中的菌群传感

1.4.4 菌群传感网络结构

1.5 研究目标、内容及意义

1.5.1 研究目标与内容

1.5.2 研究意义

第二章 材料和方法

2.1 培养基

2.2 菌株培养和保藏条件

2.3 抗生素的使用

2.4 DNA 常规操作技术

2.5 PLT 和PCA 的定量分析

2.6 Β-半乳糖苷酶活性的测定

2.7 大肠杆菌和假单胞菌感受态细胞的制备

2.8 假单胞菌和大肠杆菌高效接合转移方法

第三章 假单胞菌株M18LAS 菌群传感系统的鉴定及功能研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株与质粒

3.2.2 假单胞菌株M18 lasI 突变株和lasR 突变株的构建

3.2.3 互补菌株的构建

3.2.4 群集运动能力(swarming motility)的检测

3.3 结果

3.3.1 lasI 和lasR 基因的PCR 克隆和测序

3.3.2 lasI 和lasR 基因产物抑制M18 菌体生长

3.3.3 las 菌群传感系统对Plt 和PCA 合成的影响

3.3.4 lasI 和lasR 基因的反式互补回复到野生型的PCA 和Plt 的水平

3.3.5 LasI 和LasR 抑制PCA 和Plt 生物基因表达

3.3.6 las 菌群传感系统参与细菌群集运动能力

3.3.7 las 突变对色素产生的影响

3.4 讨论

第四章 假单胞菌M18 调控因子RHLI 与RSMA 的相关性及对抗生物质合成代谢调控机制的分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 假单胞菌M1815mA rhlI 双突变株的构建

4.3 结果

4.3.1 rsmA rhlI 双基因突变株M18RIG 菌体生长曲线的制作

4.3.2 rsmA rhlI 双突变株对PCA 和Plt 合成的影响

4.3.3 rsmArhlI 双突变株对Plt 和PCA 生物基因表达的影响

4.3.4 RsmA 负调控rhlI 基因的表达

4.4 讨论

第五章 总结

参考文献

附录 实验所用试剂及仪器设备

致谢

攻读硕士学位期间论文（待）发表情况和所获奖励