猪嵴病毒全基因组序列分析及荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

猪嵴病毒(Porcine kobuvirus, PKoV)属微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),嵴病毒属(Kobuvirus),为单股正链RNA病毒。虽然PKoV与猪群中临床症状的关系尚不确定,但是由于阳性率较高,可能与其他病毒一起发生混合感染而导致疾病。目前国内外针对猪嵴病毒的研究甚少,因此有必要对其进行相关基础研究。本研究主要内容包括：
　　⑴根据GenBank上发表的PKoV全基因组序列,在3D保守区设计特异性引物,对上海周边地区采集的116份猪粪样品进行PCR检测。结果显示PKoV阳性率为38.8％(45/116)。在三个猪场(分别位于青浦区、闵行区和奉贤区)中,阳性率分别为46.7%(21/45)、35.1%(13/37)和32.4%(11/34),结果证实PKoV在上海周边地区猪群中广泛存在。利用SPSS13.0软件对实验统计结果进行分析,结果表明仔猪可能比育肥猪更容易感染PKoV,并且可能与腹泻有关。利用MEGA4.0软件进行系统进化分析,结果表明在上海地区PKoV存在基因多样性。
　　⑵根据已知的PKoV全基因组序列设计10对引物,进行全基因组序列扩增并进行序列分析。结果显示:病毒的基因组长度为8210nt,仅含有一个由7467个核苷酸组成的开放阅读框(open reading frames, ORF),编码一个多聚蛋白为2488 aa。通过与参考毒株基因组序列Y-1-CH(GU292559)和S-1-HUN(EU787450)的比较,发现结构蛋白区比非结构蛋白区具有更多的基因突变。应用Simplot软件对PKoV进行全基因组序列的基因重组分析,结果表明该毒株可能发生了早期的部分基因重组,可能是PKoV基因多样性的一个重要基础。
　　⑶根据PKoV的全基因组序列设计引物,通过对反应条件的优化,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并与常规RT-PCR检测方法进行了比较。结果显示,在模板浓度7.02×101~7.02×109拷贝/μL范围内建立的标准曲线,荧光阈值(Ct)与其呈现较好的线性关系(r2=0.9975),融解曲线特异,检测灵敏度下限达7.02×101拷贝/μL,而常规RT-PCR方法的检测下限为7.02×103拷贝/μL,重复性变异系数小(<1%)、稳定性高,能特异地检测PKoV,适合于PKoV感染的临床监测或流行病学调查等相关研究。对116份猪粪样品的检测结果进一步表明该方法(检出64份)比常规RT-PCR方法(检出45份)的灵敏度高。

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第一章 文献综述

1猪嵴病毒的研究进展

2 荧光定量PCR技术研究进展

3 本研究的目的与意义

第二章 上海近郊地区猪嵴病毒流行病学调查

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三章 猪嵴病毒全基因组序列的扩增及分析

1 猪嵴病毒（SH-W-CHN）全基因组序列测定

2 结果

3 讨论

4 小结

第四章 猪嵴病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

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