第一章 文献综述
1.1 金属硫蛋白的概述
1.1.1 金属硫蛋白基本特征及分类
1.1.2 金属硫蛋白的转录表达与调控
1.1.3 金属硫蛋白的生物学功能
1.2 四膜虫金属硫蛋白研究进展
1.2.1 四膜虫金属硫蛋白的分类
1.2.2 四膜虫MTs中Cys和Lys排布分析
1.2.3 四膜虫MTs的转录表达和调控
1.2.4 四膜虫MTs进化假说
1.3 本研究的目的和意义
第二章 截短型MTT1和截短型MTT2的功能比较
2.1 材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 主要试剂和工具酶
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要试剂配制
2.2 方法
2.2.1 pGEX-TM1和pGEX-TM2质粒构建
2.2.2 重组质粒 pGEX-TM1、pGEX-TM2、pGEX-MTT1和pGEX-MTT2在大肠杆菌中的表达
2.2.3 GST-TM1、GST-TM2、GST-MTT1和GST-MTT2的纯化
2.2.4 金属/GST-MT配合物制备
2.2.5 金属/GST-MT配合物与DTNB反应
2.2.6 毒性试验
2.2.7 不同大肠杆菌对不同金属离子的原子吸收分析
2.2.8 不同重组菌株在Cd2+和Cu2+压力下的增殖分析
2.2.9 数据处理及分析
2.3 结果
2.3.1 不同亚型金属硫蛋白的序列分析
2.3.2 GST-MTT1、GST-MTT2、GST-TM1和GST-TM2的表达与纯化
2.3.3 重金属离子对不同重组菌株的急性毒理分析
2.3.4 金属离子压力下不同重组菌株的增殖分析
2.3.5 金属离子压力下重组菌离子累积分析
2.3.6 不同金属硫蛋白复合物稳定性分析
2.4 讨论
第三章 嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT5功能分析
3.1 材料
3.1.1 细胞株、菌株和质粒
3.1.2 主要试剂和工具酶
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 主要试剂配制
3.2 方法
3.2.1 四膜虫的培养
3.2.2 四膜虫大核基因组提取
3.2.3 四膜虫mRNA的提取
3.2.4 反转录cDNA
3.2.5 PCR产物的纯化
3.2.6 MTT5基因侧翼序列克隆
3.2.7 pN-MTT5敲除载体构建
3.2.8 MTT5基因的克隆
3.2.9 pMD18-T-MTT5′构建
3.2.10 基因突变
3.2.11 表达质粒pGEX-MTT5构建
3.2.12 四膜虫细胞的转化、筛选及鉴定
3.2.13 Cd2+、Cu2+和Pb2+胁迫对细胞株的抑制
3.2.14 MTs基因的表达分析
3.2.15 pGEX-MTT5质粒在大肠杆菌中的表达
3.2.16 GST-MTT5纯化
3.2.17 apoMTT5蛋白的获取
3.2.18 MTT5蛋白的定量分析
3.2.19 MTT5蛋白结合目的离子
3.2.20 MTT5荧光光谱分析
3.2.21 Cd-MTT5、Cu-MTT5、Pb-MTT5复合物与DTNB反应
3.2.22 毒性试验
3.2.23大肠杆菌BL21/pGEX-MTT5对不同金属离子原子吸收分析
3.2.24 数据处理及分析
3.3 实验结果
3.3.1 四膜虫MTs基因序列及其蛋白序列分析
3.3.2 ΔMTT5突变细胞筛选及鉴定
3.3.3 敲除MTT5基因突变细胞对不同金属离子的耐受性分析
3.3.4 不同金属离子压力下ΔMTT5细胞中MTT1、MTT2、MTT3和MTT4的表达分析
3.3.5 GST-MTT5融合蛋白的表达与纯化
3.3.6 MTT5结合金属离子数量分析
3.3.7 金属离子结合性能分析
3.3.8 重金属离子对大肠杆菌BL21/pGEX-MTT5的毒性分析
3.3.9大肠杆菌BL21/pGEX-MTT5对不同金属离子累积性分析
3.4.讨论
第四章 嗜热四膜虫金属硫蛋白对重金属离子诱导的氧化应激效应分析
4.1 材料
4.1.1 菌株
4.1.2 主要试剂和工具酶
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 主要试剂配制
4.2 方法
4.2.1 四膜虫的培养
4.2.2 细胞株在Cd2+、Cu2+和Pb2+的胁迫
4.2.3 抗氧化基因的表达分析
4.2.4 四膜虫mRNA的提取
4.2.5 反转录cDNA
4.2.6 Cd2+、Cu2+和Pb2+胁迫对突变细胞ROS的影响
4.2.7 Cd2+、Cu2+和Pb2+胁迫下细胞蛋白提取
4.2.9 细胞中SOD、CAT和GSH 活性的影响
4.2.10数据处理及分析
4.3结果
4.3.1敲除MTs后突变细胞对金属离子敏感性分析
4.3.2 Cd2+、Cu2+和Pb2+胁迫下突变细胞氧化应激分析
4.4.3氧化应激过程中抗氧化酶基因（SOD、CAT和GPX）的转录分析
4.4.4 金属离子诱导下突变细胞中抗氧化酶活性分析
4.4讨论
第五章 嗜热四膜虫锌指结构蛋白Zfp1影响离子胁迫下金属硫蛋白基因的表达
5.1 材料
5.1.1 细胞株、菌株和质粒
5.1.2 主要试剂和工具酶
5.1.3 主要仪器设备
5.1.4 主要试剂配制
5.2 方法
5.2.1 四膜虫的培养
5.2.2 四膜虫大核基因组提取
5.2.3 敲除载体构建
5.2.4 细胞转化及突变株筛选
5.2.5 Cu2+和Cd2+胁迫对细胞株的增殖抑制
5.2.6 四膜虫mRNA的提取
5.2.7 反转录cDNA
5.2.8 MTs基因的表达分析
5.3 实验结果
5.3.1 嗜热四膜虫ZFP1基因分析
5.3.2 ΔZFP1突变细胞株的鉴定
5.3.3 ZFP1的敲除影响了细胞对Cu2+和Cd2+的耐受性
5.3.4 ZFP1的敲除影响了Cu2+和Cd2+离子胁迫下MTs的表达
5.4 讨论
总结
展望
参考文献
附录1 缩略语表
附录2 主要的仪器设备
博士期间发表论文情况
致谢
承诺书
声明
