膜引导结合Adv-BMP-2局部基因治疗老年性骨缺损的实验研究

摘要

目的： 探讨在老年骨再生功能低下时应用膜引导结合Adv-BMP-2局部基因治疗对骨缺损修复的促进作用，以寻找治疗老年性骨缺损的有效方法。 1.成骨细胞的提取、体外培养和鉴定；Adv-BMP-2的扩增、纯化、滴度测定；Adv-BMP-2对成骨细胞生物学行为的影响。 2.TNF-α对于成骨细胞生长的影响和对BMP受体表达的调控作用。 3.手术建立大鼠去势后骨质疏松牙槽骨缺损动物模型，为进一步的动物实验奠定基础。 4.应用体外法(ex vivo)进行BMP-2基因转移,研究Adv-BMP-2对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复的成骨效果。 5.异体冷冻骨膜与e-PTFE膜复合红骨髓对颌骨缺损成骨性能的比较分析。 6.通过老年大鼠骨质疏松骨缺损动物模型,采用体内法(in vivo)进行BMP-2基因转移结合膜引导修复老年性骨缺损并与其他不同植骨材料进行比较，以寻找治疗老年性骨缺损的有效方法。 方法： 1.成骨细胞的提取、体外培养和鉴定。原代成骨细胞来自出生1周Wistar乳鼠，进行成骨细胞培养，通过形态学观察、ALP染色、体外矿化实验，鉴定成骨细胞是否培养成功。Adv-BMP-2的扩增、纯化、滴度测定。观察成骨细胞转染Adv-BMP-2后生物学行为的变化。 2.采用MTT及PNPP法检测不同浓度TNF-α对于成骨细胞增殖和分化的影响。在保证细胞量相等的前提下，利用RT-PCR技术测定不同浓度TNF-α对于成骨细胞BMP受体表达的调控作用。 3.建立大鼠骨质疏松牙槽骨缺损动物模型并通过各种检测方法证实模型建立。40只3月龄雌性大鼠随机分为4组，A组:SO组；B组：OVX组；C组：BD组；D组：OVX+BD组。术后8周、12周测定大鼠体重变化；血清中ALP、Ca、 P含量及子宫重量系数变化；用双能X线吸收法(DEXA)行颌骨密度和骨矿含量测定。 4.20只健康雌性Wistar大鼠，随机分为2组。实验组：A组为Adv-BMP-2转染成骨细胞/CS组(A/C组)；对照组：B组为去势牙槽骨缺损对照组(OB组)。分别在第8周、第12周处死动物，获取标本并行大体观察、X线检查、组织学检查。 5.将健康Wistar大鼠断颈法处死后取颅骨顶骨骨膜制备异体冷冻骨膜(variant deepfreeze periosteum，VDP)备用。24只成年Wistar大鼠随机分为3组。于下颌骨升支部制造约0.5cm×0.5cm的骨缺损。A组：SO组：B组：e-PTFE/RBM组；C组:VDP/RBM组。分别在第4周、第8周处死动物，获取标本行大体观察、x线检查、组织学检查。观察不同膜引导成骨性能的效果。 6.40只雌性，老年Wistar大鼠22月龄(体重330+32g)，SPF级(无特定病原体动物)，随机将40只Wistar大鼠分为ABCDE五组： A组为SO组；B组为VDP/Adv-BMP-2/CS组；C组为VDP/Perioglas组；D组为VDP/HPPA组；E组为VDP/Adv-GFP/CS组。于下颌骨升支部制造约0.5cm X 0.5cn的的全厚下颌骨缺损模型，BCD实验各组分别植入不同材料。A组为对照组未植入任何材料，作为空白对照。分别于术后第8周、第12周处死动物。获取标本并行大体观察、x线检查、组织学检查、免疫组化检查。E组行体内绿色荧光蛋白成骨示踪，观察各组不同时期的新生骨量并进行统计学比较。 结论： 1.体外实验证实：Adv-BMP2对成骨细胞增殖功能和分化功能有明显促进作用。为后续BMP-2基因治疗的应用研究奠定了基础。 2.当TNF-α浓度大于50ng/ml时对于成骨细胞增殖就有明显的抑制作用。当TNF-α的浓度大于5ng/ml时对于成骨细胞分化有明显抑制作用。不同浓度TNF-α均可以抑制BMP-IA和B MlPR-II基因的表达，但对BMP-IB却有促进作用。总体说来，TNF-α对于BMPR复合体起抑制作用。 3.可以手术制备大鼠骨质疏松牙槽骨缺损动物模型，为进一步的动物实验奠定基础。 4.体外法(ex vivo)进行BMP-2基因转移修复骨质疏松牙槽骨缺损，Adv-BMP-2对于骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复有明显的促进作用。 5.VDP及e-PTFE不同引导膜都可引导大鼠颌骨缺损骨组织修复。 6.体内法(in vivo)进行BMP-2基因转移结合膜引导修复老年大鼠骨缺损比其它材料较早地引导了新骨形成，是一种理想的骨组织替代材料。特别是对老年骨再生能力低下骨缺损的修复有明显的促进作用。

目录

论文说明：符号说明

声明

第一部分

实验一Adv-BMP-2对大鼠成骨细胞生长的影响

一、大鼠成骨细胞的培养和鉴定

二、Adv-BMP-2转染大鼠成骨细胞

三、Adv-BMP-2对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

讨论

实验二TNF-α对成骨细胞生长影响和对BMP受体表达的调控作用

一、TNF-α对成骨细胞生长的影响

二、TNF-α对成骨细胞BMP受体表达的调控作用

小结

附图

参考文献

第二部分

实验一骨质疏松症牙槽骨缺损动物模型的建立

实验二Adv-BMP-2局部基因治疗骨质疏松牙槽骨缺损的实验研究

小结

附图

参考文献

第三部分

实验一VDP与e-PTFE膜引导骨缺损成骨性能的比较分析

实验二膜引导结合BMP-2局部基因治疗老年性骨缺损的实验研究

小结

附图

参考文献

全文总结

致谢

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