间充质干细胞在牙周/骨再生中作用的实验研究

摘要

牙周病治疗的最终目标是实现因炎症丧失的牙周组织的重建，恢复牙周组织的结构和功能，即实现牙周组织再生。牙周组织的再生包括因炎症破坏吸收导致的硬组织(牙槽骨与牙骨质)的再生和软组织(牙周膜与牙龈)的再生。关于牙周组织再生的研究由来已久，以往通常采用的方法是引导组织再生术(Guided tissue regeneration，GTR)，其主要原理是通过屏障膜阻挡牙龈上皮和结缔组织与牙齿根面接触，延缓上皮的根向迁移，使牙周组织前体细胞聚集于根面，并迁移、增殖、分化、建立新附着，但此方法无法实现牙周组织的完全再生。组织工程技术的出现为实现牙周组织的完全再生提供了全新的思路和方法。牙周组织再生要求3个基本生物学因素的参与，即种子细胞、生长分化诱导因子和细胞外基质材料，种子细胞在特定环境下可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞或牙周膜细胞等功能性细胞。胚胎干细胞和成体干细胞都可以作为牙周组织工程的种子细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)属于成体干细胞，是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等，在细胞替代治疗及组织工程方面具有极大的应用价值。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力呈现明显下降的趋势，故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细胞，已越来越受到各国学者的关注。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的发现，使以干细胞为基础的组织工程技术治疗牙周病成为可能，也使GTR的临床疗效更为确切，被认为是牙周组织工程中一种比较理想的种子细胞。但是PDLSCs来源比较有限，只能在拔牙后获得，并且其培养、分离、纯化和扩增过程复杂、周期较长，因此限制了PDLSCs的临床应用。牙龈干细胞(Gingiva-derived mesechymal stem cells，GMSCs)具有取材方便、易大量扩增、核型稳定等特点，这些优势是PDLSCs所不能比拟的。因此我们推测GMSCs可能代替PDLSCs成为牙周组织工程中一种更有临床实际意义的种子细胞。最近我们和其它的几个实验小组从脐带中分离得到了MSCs即脐带间充质干细胞(Umbilical cord dedved mesenchymal stem cells，UCMSCs)。与BMSCs相比，UCMSCs具有组织来源丰富、细胞原始、增殖能力强和安全无病毒感染风险等优点，并且成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为干细胞领域研究中的新热点，为MSCs的临床应用包括牙周组织工程的临床应用带来更加广阔的前景。
　　 目的：利用大鼠颅骨极限缺损模型和牙周开窗模型，首次探讨了GMSCs和UCMSCs在骨组织缺损和牙周组织缺损中的修复作用，为牙周组织工程的临床应用提供证据。
　　 方法：⑴利用组织块法从临床上导萌术切下的牙龈和因正畸需要拔除的牙齿(无龋病及牙周病)的牙龈中获得原代细胞，消化传代后，取P3-P4的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法，挑取单个克隆获得具有干细胞特性的细胞-GMSCs，进行传代培养。在体外以10-8mol/L地塞米长松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C诱导GMSCs向成骨细胞分化，早期成骨用ALP染色鉴定，晚期以Von Kossa染色法检测钙化结节的形成；以10-8M地塞米松、200μM吲哚美辛、0.5mM IBMX和6 ng/ml胰岛素诱导GMSCs向脂肪细胞分化，并用油红O(Oil Red O)染色检测脂肪滴的形成；以6.25μg/ml胰岛素、50nM维生素C和10ng/ml转化生长因子β(TGF-β)诱导GMSCs向软骨细胞分化，并以阿尔新兰染色法进行鉴定。RT-PCR检测诱导后细胞的特异性产物的表达情况。体外诱导实验以未加诱导因子的完全培养基培养的同代GMSCs为对照。⑵在无菌条件下，利用酶消化法从剖宫产的新生儿脐带中获得原代的脐带成纤维细胞，消化传代后，取P3-P4的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法、挑取单个克隆获得具有干细胞特性的细胞-UCMSCs，进行传代培养。采用与GMSCs成分相同的成骨、成脂肪和成软骨诱导培养液对UCMSCs进行诱导培养，用ALP染色、Von Kossa染色、油红O染色、阿尔辛兰染色和RT-PCR检测诱导后的成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞和特异性产物的表达情况。体外诱导以未加诱导因子的完全培养基培养的同代UCMSCs为对照。⑶利用慢病毒载体将增强型绿色荧光蛋白(pBPLV-eGFP)转入包装细胞293FT，获得稳定的产毒细胞株；然后用含有eGFP病毒的培养液感染GMSCs和UCMSCs，经流式分选后获得eGFP+GMSCs和eGFP+UCMSCs，将细胞在成骨诱导液中培养10天，诱导后的细胞分别与胶原支架复合，然后移植入大鼠极限性颅骨缺损模型和大鼠下颌骨牙周开窗模型中，利用H&E染色、免疫组织化学染色评价GMSCs和UCMSCs对骨缺损和牙周缺损的修复情况，动物实验以单纯移植胶原材料的缺损为对照组。
　　 结果：①组织块贴壁5天后，倒置显微镜观察可见大量细胞从组织块周围爬出，当细胞密度达到瓶底的70％-80％时，可进行传代培养。用有限稀释法获得成纤维细胞集落克隆形成单位(CFU-F)，将单个克隆扩大培养，获得具有自我更新能力的人GMSCs。经流式细胞仪检测细胞表面标记发现，人GMSCs表达CD29，CD105，CD90，STRO-1，而不表达CD34，CD45。GMSCs经骨向诱导培养基诱导2周后，ALP染色阳性，诱导4周后，经Von kossa染色后可见致密棕染的细胞外基质沉积，RT-PCR结果显示诱导后细胞表达成骨细胞特异性产物ALP和OCN；GMSCs向脂肪细胞方向诱导2周后，经油红O染色，可见有红色脂肪滴形成，RT-PCR结果显示诱导后细胞表达脂肪细胞的特异性产物Adipsin和PPARγ2；细胞向成软骨细胞方向诱导7周，阿尔新兰染色后，可见类软骨样嗜阿尔新兰细胞的基质沉积，RT-PCR结果显示诱导后细胞表达成软骨细胞的特异性产物CoLⅡ和ACG。②酶消化法后3天左右，倒置显微镜观察可见视野内大量的短梭状细胞贴壁，当细胞密度达到瓶底的70％-80％时，可进行传代培养。用有限稀释法获得CFU-F，将单个克隆扩大培养，获得人UCMSCs。经流式细胞仪检测，可知UCMSCs表达CD29，CD105，CD90，CD44，而不表达CD34和CD45。UCMSCs经骨向诱导培养基诱导2周后，ALP染色阳性，诱导4周后，经Von Kossa染色后可见大量致密棕染的细胞外基质沉积，RT-PCR结果显示诱导后细胞表达成骨细胞特异性产物ALP和OCN；UCMSCs向脂肪细胞方向诱导培养2周后，经油红O染色，可见红色脂肪滴形成，RT-PCR结果显示诱导后细胞表达脂肪细胞的特异性产物Adipsin和PPARγ2；UCMSCs向成软骨细胞方向诱导7周经阿尔新兰染色后，可见类软骨样嗜阿尔新兰细胞的基质沉积，RT-PCR结果显示，诱导后细胞表达成软骨细胞的特异性产物CoLⅡ和ACG。③用含有eGFP的病毒液感染P3/P4代的GMSCs和UCMSCs，经荧光显微镜观察可见视野中大部分细胞均可发出明亮的绿色荧光，经流式细胞仪分选后获得eGFP+GMSCs和eGFP+UCMSCs，扩大培养后经骨向诱导培养基诱导10天，诱导后的细胞分别与胶原支架材料复合后移植入大鼠极限性颅骨缺损模型和大鼠下颌骨牙周开窗模型中。移植eGFP+GMSCs的颅骨和下颌骨，经过8周的愈合，H&E染色可见缺损已封闭，并且有新骨的形成，免疫组化显示新骨中OPN，CoLⅠ，GFP为阳性表达；对照下颌骨中仅有少量新生骨形成，颅骨中几乎没有新骨生成。移植eGFP+UCMSCs的大鼠极限性颅骨缺损和牙周开窗模型中，不仅有新生骨组织的形成，在牙周开窗模型中还可见新生牙骨质和牙周膜的形成，新生组织的OPN，CoLⅠ，GFP染色结果为阳性；对照牙周开窗模型中无新生牙骨质和牙周膜的出现，仅有少量新生骨形成，颅骨缺损中几乎没有新骨形成。
　　 结论：⑴GMSCs和UCMSCs与其它干细胞一样具有自我更新的能力，能够表达干细胞特异性的表面标记，并且具有三向分化的能力。⑵GMSC可用于修复牙周组织/骨缺损，可以作为牙周/骨组织工程种子细胞；UCMSCs可用于修复骨组织缺损和牙周组织缺损，可以作为牙周组织工程的种子细胞。