前列腺癌组织胆碱摄取值与其肿瘤生物学行为相关性的初步研究

摘要

第一部分，前列腺癌组织胆碱摄取值与其肿瘤生物学行为相关性的初步研究
　　 研究背景及目的：
　　 恶性肿瘤细胞的分裂增生非常旺盛，因而细胞膜的生物合成也非常活跃。理论上，作为细胞膜构成上的重要组分的胆碱在体内的摄取、代谢情况可以反映肿瘤组织细胞的增殖情况，从而与其肿瘤生物学行为相关。经同位素11C标记的胆碱也因此被发展成为一种核医学检查的示踪剂，用于对恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断。然而该法在临床实际应用于初诊前列腺癌显像过程时，胆碱在恶性肿瘤组织中的标准摄取值(standarduptakevalue，SUV)往往个体差异非常大，且其数值往往受多种因素影响，甚至单凭胆碱摄取值难以有效鉴别前列腺良恶性病变，因此关于其在前列腺癌诊断中的意义存在争议。有鉴于此，在本项研究中，我们应用11C_胆碱PET/CT技术对前列腺癌进行显像中，同时记录前列腺癌病灶胆碱最大SUV值(SUVmax)以及同层臀大肌SUVmax值，以后者为背景计算其比值SUVmax-P/M值。以SUVmax及SUVmax-P/M值作为描述前列腺癌病灶胆碱摄取的指标，分析其与患者肿瘤病理分级、分期以及多个肿瘤生物学行为分子标记物表达情况的相关性，探讨胆碱摄取在前列腺癌发生发展中的意义，并进一步评估11C-胆碱核素显像技术在前列腺癌的诊治中的应用价值。
　　 研究方法：
　　 1.病例资料共计26例于2007年四月-2010年三月接受11C_胆碱PET/CT的前列腺癌患者纳入本项研究，均经超声引导下的经直肠前列腺穿刺组织活检术证实为前列腺癌。26例患者平均年龄67.1岁，按照AJCC(2002)标准进行临床分期，其中Ⅱ期患者10例，Ⅲ期患者5例，Ⅳ期患者11例。Gleason积分平均7.2±1.3，7(4+3)分及以上者14例。所有患者在接受PET/CT检查前均未行雄激素阻断治疗以及其他任何有创性操作，前列腺组织活检于PFT/CT检查完成后进行，且以PET/CT显像结果为参照，对可疑病灶区域予以重点穿刺取样，留取前列腺癌组织标本。
　　 2.11C_胆碱PET/CT显像及数据分析11C-胆碱的制备由GEMINItrace回旋加速器生产11C，采用固相一步法全自动方法合成11C-胆碱。患者于静脉注射7.4MBq/kg11C-胆碱5分钟后行仰卧位PET/CT显像。行4排螺旋CT扫描后，PET采用2D扫描，采集2个床位（盆腔），可疑转移患者采集6个床位（全身）。PET数据经OSEM重建，通过Xeleris工作站进行图像融合分别得到冠状、矢状、横断的CT、PET及PET/CT融合图像。
　　 在前列腺病灶浓聚灶部位按病灶形状勾画感兴趣区(regionofinterest，ROI)，计算并记录出该部位的最大标准摄取值(SUVmax);同法在病灶同层面臀大肌测量SUVmax，并计算其与前列腺病灶SUVmax的比值即SUVmax-P/M值。
　　 3.免疫组织化学检测前列腺组织石蜡切片经脱蜡、水化、高温抗原修复后，按照Envision二步法对Ki-67、雄激素受体、CD31、Her-2/neu、PTEN和Bcl-2进行免疫组织化学染色，并对结果予以定量/半定量评分或定性评价。
　　 4.统计学分析将11C-胆碱PET/CT结果，包括前列腺病灶SUVmax以及SUVmax-P/M值，与患者临床病理资料及免疫组化检测结果的关系以SPSS17.0进行统计学分析。
　　 研究结果：
　　 1.26例患者前列腺癌病灶SUVmax值平均为9.42±6.70(1.69-24.65)，SUVmax-P/M值平均为4.33±1.41(1.18-7.44)。如以SUVmax-P/M值2.3为诊断前列腺癌的界值，其诊断敏感度为88.6％。Ⅱ期与Ⅲ期患者间SUVmax值与SUVmax-P/M值均无显著的统计学差异，但两者在Ⅳ期患者中均显著升高。Spearman等级相关分析显示SUVmax值与SUVmax-P/M值与Gleason积分均无明显相关性，但是在Gleason积分7分(4+3)及以上的患者组的SUVmax-P/M值显著的高于Gleason积分7分(3+4)及以下的患者组，而两组的SUVmax值无明显差异。
　　 2.26例患者以Ki-67标记增殖指数平均为10.4±13.1(0-48)，以CD31标记计算微血管密度(MVD)平均为26.4±11.8(7-48)，雄激素受体半定量评分平均为86.5±61.8(0-180)。Spearman等级相关分析显示SUVmax-P/M值与增殖指数、MVD值均具有统计学相关性，而与雄激素受体表达情况无明显相关;SUVmax值则与上述指标均无相关性。26例患者中判定为Her-2/neu，Bcl-2及PTEN表达阳性的患者分别为6例，13例及11例。其中Her-2/neu表达阳性的患者SUVmax-P/M值明显高于阴性的患者，具有统计学差异。Bcl-2及PTEN表达呈阳性及阴性组间SUVmax-P/M值无明显差异。SUVmax值在此3个指标表达阳性及阴性组中均无明显差异。
　　 研究结论：
　　 以同层肌肉SUVmax值校正后的前列腺癌病灶胆碱摄取值SUVmax-P/M值与前列腺癌患者的临床分期、Gleason积分以及Ki-67等指标表达间均有一定的相关性，能较好反映前列腺癌的肿瘤生物学行为。以SUVmax-P/M值作为描述前列腺癌组织胆碱摄取情况的指标，可为前列腺癌患者临床分期、肿瘤恶性程度、治疗方案选择以及预后估计等多个方面提供有益信息，具有很高的临床应用价值。
　　 第二部分，钙调蛋白拮抗剂小檗胺抗前列腺癌作用机制的体内外实验研究
　　 研究背景及目的：
　　 前列腺癌是目前西方国家男性最为常见的恶性肿瘤之一,近年来随着我国生活水平的上升和饮食生活习惯的西化,前列腺癌的发病率也在快速上升,现已位居泌尿系统恶性肿瘤发病率的第三位,但与西方不同,我国大多数前列腺癌患者就诊时译处于晚期,无法行手术根治性切除,只能采用内分泌治疗为主的药物治疗。其机理主要是通过阻断阻断雄激素分泌以及对抗雄激素作用,从而抑制受雄激素促进的肿瘤细胞增殖、以及诱导雄激素依赖性肿瘤细胞发生凋亡,达到抑制肿瘤生长的目的。但是多数患者会在内分泌治疗开始后2-3年内转变成去势抵抗性前列腺癌(CRPC),此时则已有内分泌治疗手段即开始宣告失效。另一方面,目前化疗药物对前列腺癌效果均不理想,因而寻找新的抗前列腺癌药物显得十分必要。
　　 钙调蛋白是一种生理功能调节剂,在细胞生长增殖过程中起重要作用。在恶性增殖的细胞中,钙调蛋白的含量和活性均高出正常细胞。钙调蛋白可与雄激素受体直接结合,两者在结构和功能上密切相关。体外实验发现,给予钙调蛋白拮抗剂可显著抑制雄激素受体阳性的前列腺癌细胞系的增殖及诱导凋亡,其作用效能类似抗雄激素药物。但是,目前已有的钙调蛋白拮抗剂,如W7、三氟拉嗪等药物对人体不良反应较大,难以广泛应用于临床前列腺癌的治疗。
　　 小檗胺是从我国中草药小檗属植物中提取的的一种双苄基异喹啉类生物碱,被广泛用于治疗各种原因尤其是肿瘤放化疗引起的白细胞减少症已有数十年,安全有效、价格低廉是其突出的优势。而通过对小檗胺的化学结构进行分析发现该药物亦属钙调蛋白拮抗剂。我们课题组以往的研究发现小檗胺在体外可有效抑制前列腺癌细胞增殖,并可通过上调bax基因、下调survivin基因的表达诱导前列腺癌细胞发生凋亡,并推测该药物对不同前列腺癌细胞系的作用活性的差异可能与其钙调蛋白含量有关。以此为基础,本研究以不同雄激素受体表达情况的细胞系为研究目标,进一步探讨小檗胺体外抗前列腺癌作用的机制,并对其体内抗前列腺癌作用的效能进行评估,以期为小檗胺应用于前列腺癌的临床药物治疗提供实验和理论依据。
　　 研究方法：
　　 1.小檗胺抗前列腺癌作用机制的体外实验研究选择雄激素依赖性且雄激素受体阳性表达的前列腺癌细胞系LNCAP、雄激素非依赖性但雄激素受体弱阳性表达细胞系CWR22RV1以及雄激素非依赖性且雄激素受体阴性细胞系PC3进行体外培养,取对数生长期细胞用于实验研究。MTT法检测不同浓度小檗胺对此三种细胞系细胞活力的影响,计算增殖抑制率及IC50；流式细胞术检测小檗胺对三种细胞系细胞周期的影响。Caspase-3/8/9活性检测试剂盒测定小檗胺对LNCAP、PC3细胞相应Caspase凋亡酶活性的影响,以推测其可能介导的凋亡通路。Western-blotting法检测小檗胺对LNCAP、PC3细胞Fas蛋白、雄激素受体表达情况的影响。
　　 2.小檗胺对前列腺癌细胞体内作用的研究实验4-6周龄雄性balb-c/nu-nu裸小鼠24只,饲养于SPF环境中,分别于背部皮下接种相应对数生长期CWR22RV1细胞混悬液0.2毫升,细胞计数约107个。待前列腺癌细胞皮下移植成瘤后,随机分为小檗胺处理与对照组,处理组为按60mg/kg体重每日腹腔注射小檗胺溶液,对照组以等剂量生理盐水注射,每周测量、计算移植瘤体积,描绘生长曲线。处理4周后处死裸小鼠,切取移植瘤脱水、浸蜡,制作石蜡切片,以TUNEL法检测凋亡情况,计算凋亡指数(AI)；免疫组织化学法检查PCNA表达情况以反映移植瘤细胞增殖情况。
　　 研究结果：
　　 小檗胺对LNCAP、CWR22RV1及PC3细胞均显示出明显的抑制增殖作用,抑制作用以对LNCAP细胞最强,而对PC3细胞作用最弱,且均呈明显的剂量依赖性。LNCAP、CWR22RV1及PC3细胞的48小时IC50分别为为15.06μg/ml、31.49μg/ml及37.04μg/ml。流式细胞术检测显示小檗胺处理后LNCAP细胞G1期细胞显著增多,而S期及G2期细胞减少,而CWR22RV1细胞及PC3细胞则均出现了S期阻滞,尤以PC3阻滞于S期的细胞比例为高。Caspase酶活性分析显示小檗胺处理后LNCAP及PC3细胞均出现不同程度的Caspase-3/8/9活性升高,尤其LNCAP细胞出现了显著强于PC3细胞的Caspase-8的活性升高,提示经小檗胺处理后,两种细胞均存在内源性凋亡通路激活,而LNCAP同时出现了比更为显著的外源性凋亡通路的激活,这可能是LNCAP细胞对小檗胺更为敏感的原因。Western-blotting检测发现小檗胺处理后LNCAP细胞Fas蛋白表达明显升高,而PC3细胞未查见类似变化；同时LNCAP细胞在经过40μg/ml小檗胺处理48小时后细胞内雄激素受体水平出现明显下降。
　　 体内实验24只裸小鼠皮下接种CWR222RV1细胞均获得成功,估算移植瘤体积达约100mm3后即随机编入小檗胺处理组及对照组进行药物干预。结果显示,小檗胺处理组移植瘤生长速度显著慢于对照组。实验期间裸小鼠无意外死亡,药物干预结束后剖取移植瘤,称重计算移植瘤抑制率达45.1％。TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率,对照组平均为4.7%,小檗胺处理组则为21.2%；免疫组织化学法检测移植瘤PCNA表达,对照组平均为78.8%,小檗胺处理组则为40.9%,组间均具有显著的统计学差异。
　　 研究结论：
　　 本研究结果提示小檗胺在体外对多种前列腺癌细胞系均具有增殖抑制作用,且其活性与细胞表达雄激素受体情况一致。小檗胺处理使雄激素依赖性前列腺癌细胞周期阻滞于G1期,而雄激素非依赖性前列腺癌细胞细胞周期阻滞于S期。小檗胺对雄激素依赖性及非依赖性前列腺癌细胞均可激活内源性凋亡通路,而在雄激素依赖性前列腺癌细胞可同时明显激活外源性凋亡通路,其对外源性活性通路的激活可能与Fas受体上调有关,同时一定浓度的小檗胺处理可以引起细胞内雄激素受体含量的下降,这可能与其抑制钙调蛋白对雄激素受体的保护作用有关。此外,小檗胺亦可通过抑制增殖、诱导凋亡显著抑制前列腺癌细胞裸小鼠移植瘤的生长,表现出明显的体内抗前列腺癌作用,有望成为一种新型有效的抗前列腺癌药物。