盐酸克伦特罗对BSA、胰蛋白酶和ctDNA分子水平的毒性作用研究

摘要

盐酸克伦特罗是典型的兽药添加剂，俗称“瘦肉精”，由于该药能提高胴体的瘦肉率，具有明显的经济效益，因此曾被广泛应用于动物饲养业。但研究发现，该药物经消化道进入生命体内以后代谢缓慢并不易被机体分解，具有时间累积性，且血浆半衰期较长，在肝脏、肾脏中的残留比例较高，并因此引发多种副作用，造成生命体组织器官的损伤，因此该药已被包括中国在内的多国政府禁用，但屡禁不止。
　　 蛋白质是生物机体的主要组成部分，它几乎参与了机体所有的新陈代谢活动，DNA是生命体的遗传物质，对于维持生命体正常运转发挥着不可替代的作用。而各种环境污染物通过各种方式进入生命体后的危害性表现之一即为与蛋白质和DNA等生物大分子发生相互作用，进而影响其结构和功能。因此，探讨污染物对生物大分子的毒性作用机理，从分子水平上阐明其毒性效应，有助于完善污染物的毒性评价体系，对于全面评价污染物毒性具有重要意义。
　　 本文从环境毒理学角度出发，以牛血清白蛋白、牛胰蛋白酶和小牛胸腺DNA为靶分子，通过多种光谱学手段与分子对接技术相结合的方式研究了盐酸克伦特罗对蛋白质分子和DNA分子的毒性作用机理。论文主要包括以下三个部分:
　　 第一部分:本章在模拟体内生理条件下，采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱等光谱学方法及AutoDock软件模拟，分析了CLB对BSA的作用机理。CLB对BSA造成的荧光猝灭方式为静态猝灭，二者之间通过氢键紧密结合，结合常数为1.124×103Lmol-1。BSA的二级结构受到CLB影响后骨架结构变松散，氨基酸残基所处的微环境也发生变化，由此可能阻碍BSA发挥其正常运输和储存功能，从而对机体造成损害。通过确定二者的结合模式，为研究CLB在机体内对运输蛋白的毒性作用机理提供了参考依据。
　　 第二部分:本章利用光谱和分子对接等多种实验手段研究了盐酸克伦特罗与胰蛋白酶之间的相互作用。CLB与胰蛋白酶之间通过氢键结合形成复合物，结合常数为3.26×104Lmol-1，由此引发了蛋白质荧光光谱的静态猝灭。同时，胰蛋白酶的肽链骨架变松散，其二级、三级结构及氨基酸残基的微环境均发生一定变化，酶活性也出现了明显下降。本研究为更好地理解机体内小分子药物对酶的结构和功能的影响提供了更多有用的信息。
　　 第三部分:本章研究了盐酸克伦特罗和ctDNA之间的作用机制，除了采用光谱手段（如紫外-可见吸收光谱、以中性红NR为探针的荧光光谱、圆二色谱）以外，还采用分子模拟对二者的结合模式有了更直观的了解。结合各项实验结果，沟槽结合被认为是二者之间最可能的结合模式，与氢键和范德华力是主要作用力这一热力学结果也相符。同时，DNA的构象受到CLB影响，双螺旋结构发生一定程度的改变。这一研究可以为以中性红为荧光探针研究药物小分子和DNA的相互作用提供参考，同时可以为CLB对DNA的毒性作用机理提供有用的信息。
　　 本论文的研究成果表明，兽药残留盐酸克伦特罗进入机体后以氢键的方式与蛋白质和DNA分子发生结合，从而影响大分子的结构，使空间构象和部分残基微环境发生变化，甚至影响其正常功能，显示出一定的毒性效应。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 环境污染物的毒理学研究

1．3 盐酸克伦特罗概述

1．3．1 动物性食品中兽药残留现状

1．3．2 盐酸克伦特罗应用

1．3．3 盐酸克伦特罗的毒理学研究

1．4 靶分子概述

1．4．1 蛋白质

1．4．2 核酸

1．5 研究技术与方法

1．5．1 荧光光谱法

1．5．2 紫外-可见吸收光谱

1．5．3 圆二色谱

1．5．4 分子对接

1．6 论文的研究内容和研究意义

1．6．1 研究内容

1．6．2 研究意义

第二章 盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的毒性作用的研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 CLB对BSA的荧光猝灭光谱的研究

2．3．2 荧光猝灭机制的研究

2．3．3 CLB对BSA结构的影响

2．3．4 分子模拟

2．4 结论

第三章 盐酸克伦特罗与胰蛋白酶的毒性效应的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 CLB对胰蛋白酶的荧光猝灭光谱的研究

3．3．2 荧光猝灭机制的研究

3．3．3 CLB对胰蛋白酶结构的影响

3．3．4 CLB对胰蛋白酶活性的影响

3．3．5 分子模拟

3．4 结论

第四章 盐酸克伦特罗与小牛胸腺DNA的毒性效应的研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 紫外-可见吸收光谱的研究

4．3．2 CLB对ctDNA的荧光猝灭光谱的研究

4．3．3 荧光猝灭机制的研究

4．3．4 圆二色谱研究

4．3．5 分子对接

4．4 结论

第五章 全文总结和研究展望

5．1 主要结论

5．1．1 盐酸克伦特罗对牛血清白蛋白毒性作用的机理

5．1．2 盐酸克伦特罗对牛胰蛋白酶毒性作用的机理

5．1．3 盐酸克伦特罗与小牛胸腺DNA相互作用的机理

5．2 工作展望

参考文献

致谢

硕士研究生期间发表和待发表的学术论文

攻读硕士学位期间所获奖励

硕士研究生期间参与完成的科研项目