WDFY4基因导致系统性红班狼疮易感的功能变异鉴定及机制研究

摘要

系统性红斑狼疮(SystemicLupusErythematosus，SLE)是一种典型的自身免疫性疾病，患者体内大量自身抗体的产生和免疫复合物的沉积导致了严重的炎症反应和多器官损伤。SLE具有高度的家族聚集现象，同卵双生子的患病一致率达到了24-56％，因此，SLE的发生很大程度上受到遗传因素的影响。
　　2005年，全基因组关联分析（GenomeWideAssociationStudy，GWAS）的出现，极大地促进了SLE的遗传学研究，目前GWAS已经鉴定出40多个SLE的易感位点。2009年，针对亚洲人群SLE的两个GWAS研究发现，位于10q21的WDFY4-LRRC18区域是SLE的一个易感区域。该区域中的rs877819，rs7097397和rs1913517与亚洲人群SLE相关，其中rs1913517同时位于LRRC18和WDFY4基因的内含子。2013年，有研究发现rs1913517也是高加索人群SLE的易感变异位点。
　　WDFY4是WDFY家族的第四位成员，主要表达于一些免疫组织，如淋巴结、脾脏、胸腺和扁桃体等，提示它有可能参与机体的免疫功能。WDFY4含有多个转录本，最大的转录本可编码一个含有3184个氨基酸的巨大蛋白。WDFY4最近的同源体是同一家族的WDFY3，它们的C末端都含有BEACH(Beigeandchediak-kigashi)和WD40(WD-repeat)结构域，不同的是WDFY4没有该家族特有的FYVE锌指结构域。WD40结构域存在于一系列真核蛋白中，包含该结构域的蛋白主要参与细胞信号转导调控、pre-mRNA的加工和细胞骨架的形成等。大多数包含有BEACH结构域的蛋白通常可以作为支架蛋白参与膜事件，例如:促进质膜的融合和解离。最近的研究结果发现BEACH蛋白突变可以导致多种疾病以及各种细胞畸变，如溶酶体畸变、细胞凋亡和自噬等。另外，WDFY4蛋白在多个物种间具有高度的保守性。到目前为止，关于这一保守蛋白的功能研究，仍是一个空白。
　　虽然GWAS研究已经证实了WDFY4-LRRC18区域与中国汉族人群SLE的相关性，但是这些研究主要是在中国南方汉族人群中开展的。由于关联分析的结果具有人群差异，那么，WDFY4-LRRC18是否也与中国北方汉族人群SLE有关？在该区域的3个SLE易感SNP位点中，哪个为功能变异？功能变异是如何影响SLE发生的？该区域导致SLE易感的分子机制又是什么？为了解决这些问题，我们进行了以下研究。
　　第一部分WDFY4-LRRC18区域与中国北方汉族人群SLE的关联分析
　　为了研究WDFY4-LRRC18区域中rs877819，rs1913517和rs7097397位点与中国北方汉族人群SLE的相关性，我们利用病例-对照关联研究的方法，对这三个SNP位点进行了关联分析。400例SLE患者均来自山东大学齐鲁医院和省立医院的风湿免疫科，1000例健康对照则是来自这两家医院的健康查体者，他们的年龄、种族和地理区域等相匹配。
　　所有三个位点等位基因频率及基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群体代表性。其中，2个SNP位点rs877819和rs7097397与SLE具有显著的相关性(P=0.015，OR1.36，95％CI1.06-1.75;P=0.0004，OR1.36595％CI1.148-1.622)。在病例与对照中，rs1913517位点的等位基因频率则没有明显差异（P=0.244，OR1.13195％CI0.929-1.392），说明rs1913517与中国北方汉族人群SLE没有相关性。连锁不平衡分析表明，这3个SNP的连锁不平衡性较弱，r2＜0.75。
　　本部分结果验证了GWAS的结果，表明WDFY4-LRRC18区域也是中国北方汉族人群SLE的易感位点，2个SNP位点rs877819和rs7097397与中国北方汉族人群SLE显著相关。
　　第二部分WDFY4-LRRC18导致SLE易感的基因及功能变异的鉴定
　　由于与SLE相关联的rs1913517同时位于WDFY4和LRRC18基因的内含子，那么，哪个基因才是与SLE直接相关的呢？为了鉴别出真正参与SLE发生的易感基因，我们分别检测了58名SLE患者和58名健康对照外周血单核细胞中WDFY4和LRRC18基因的相对表达水平。结果发现，与健康对照相比，SLE患者中WDFY4基因的相对表达水平显著下降(P＜0.05)，而LRRC18基因的表达则没有明显差异，说明WDFY4是SLE的易感基因，并且低表达的WDFY4与SLE的发生有关。
　　既然WDFY4是SLE的易感基因，但是与SLE有关的功能变异还不清楚。因此，我们首先选取了70名健康对照个体，对他们WDFY4基因的61个外显子进行测序，结果没有发现可能具有功能作用的新变异。
　　GWAS研究表明rs877819，rs7097397和rs1913517是WDFY4基因中SLE的易感位点，但是尚不能确定哪个是功能变异。为了从3个SNP位点中鉴别出SLE的功能变异，我们首先分析了rs877819和rs1913517位点与SLE的相关性。连锁不平衡分析表明这两个位点是强连锁的(r2=0.93)。logistic回归分析结果表明rs877819是SLE的易感SNP，p=2.5×10-4，利用独立贡献检验，在屏蔽了rs877819的作用后，rs1913517与SLE没有相关性，P=0.7758。以上结果说明rs1913517位点不是SLE的功能变异，它与SLE的易感性依赖于rs877819。
　　对于外显子中的rs7097397位点，我们采用焦磷酸测序的方法检测了rs7097397位点的等位基因特异表达(AlleleSpecificExpression，ASE)。我们选取了31个rs7097397位点AG基因型的杂合子健康个体，对其外周血单核细胞中的cDNA和基因组DNA进行焦磷酸测序，结果发现rs7097397位点等位基因表达没有差异，该位点可能不是SLE的功能变异。
　　由于rs877819位点位于内含子中，所以我们利用实时定量PCR的方法分析了rs877819等位基因对WDFY4和LRRC18基因表达的影响。鉴于rs877819A的频率非常低，AA基因型个体较少，我们只选取了rs877819位点40个GG基因型和15个AG基因型的个体，分别检测了他们外周血单核细胞中WDFY4和LRRC18基因的相对表达水平。结果发现，AG基因型个体中WDFY4基因的相对表达水平明显低于GG基因型的个体(P＜0.05)，而LRRC18的相对表达水平没有明显的差异，说明rs877819A与WDFY4基因的低表达有关。
　　本部分研究结果表明，WDFY4是SLE真正的易感基因。位于该基因内含子中的rs877819可能是导致SLE易感的功能变异，危险等位基因A与WDFY4的低表达有关，这可能是导致SLE患者中WDFY4基因低表达的原因。
　　第三部分功能变异rs877819导致SLE易感的分子机制
　　由于内含子变异rs877819的危险等位基因A与WDFY4的低表达有关，所以我们推测该位点有可能影响了基因的转录活性。为了检测rs877819不同等位基因转录活性的差异，我们进行了双荧光素酶报告基因分析。与预期相一致，在HeLa和HEK293T细胞中，rs877819罕见等位基因A的相对转录活性显著低于常见等位基因G(P＜0.001)，因此，rs877819等位基因A可能导致了WDFY4的低表达。
　　由于rs877819等位基因影响了WDFY4的转录活性，所以我们针对rs877819位点等位基因进行了电泳凝胶迁移率实验(EMSA)，验证该SNP是否为转录因子结合位点。结果发现rs877819确实能与细胞核蛋白相结合，并且等位基因G与该蛋白的结合亲和力大于等位基因A。
　　MatInspector软件预测，与rs87789位点结合的转录因子可能是Freac2，ZBTB7和Yinyang1(YY1)。所以我们合成了这3个转录因子的保守结合序列，进行竞争实验。结果发现，只有YY1的保守结合序列能完全竞争掉结合条带，所以YY1可能是与rs877819结合的转录因子。超迁移率实验(Supershift)结果也表明YY1抗体能够结合到rs877819位点的DNA-蛋白结合复合物上，而突变的YY1保守序列不能竞争结合条带，说明rs877819位点所在序列能够与转录因子YY1特异结合。与EMSA结果相一致，染色质免疫共沉淀实验(ChIP)也表明，rs877819位点也能够与转录因子YY1相结合。
　　我们的结果说明WDFY4基因的内含子变异rs877819能够与内源性YY1蛋白发生特异结合，并且罕见等位基因A与YY1的亲和力低于等位基因G，这可能是rs877819A导致WDFY4低表达的原因。
　　为了研究转录因子YY1对rs877819等位基因转录活性的影响，我们将rs877819等位基因G或A连入荧光素酶报告基因载体，并且与YY1的干扰RNA(siRNA)或表达载体(CMV-YY1)共转染细胞，进行双荧光素酶报告基因分析。结果表明，YY1对rs877819等位基因G的转录活性起正调控作用，却几乎不影响等位基因A的转录活性。
　　本部分研究结果表明，起正调控作用的转录因子YY1能够结合到rs877819位点，并且与等位基因A的亲和力较低，使得等位基因A转录活性下降，从而导致了WDFY4的低表达，而低表达的WDFY4导致了SLE的易感。
　　第四部分WDFY4基因对自噬通路的影响
　　WDFY4最相近的同源体是同一家族的WDFY3，它们的C末端都包含了相对保守的BEACH结构域和WD40结构域。WDFY3编码了一个自噬相关蛋白ALFY(autophagy-linkedFYVEprotein)，参与选择性自噬。已经有越来越多的研究表明自噬可能参与了自身免疫病的发生。既然WDFY4蛋白与WDFY3结构如此相似，那么WDFY4是否也参与自噬呢？它导致SLE的易感是否是通过自噬通路实现的呢？带着这些问题，我们首先检测了WDFY4基因的表达模式以及狼疮小鼠脾脏中的自噬水平。结果发现，无论是人类还是小鼠的脾脏、胸腺等免疫组织中，WDFY4的表达水平高于其它组织。另外，与对照小鼠相比，狼疮小鼠脾脏中，Wdfy4表达水平下降，自噬水平升高。那么，自噬水平的升高是否与Wdfy4的低表达有关呢？
　　我们检测了WDFY4在Jurkat，NK92，Raji和THP-1等不同免疫细胞中的表达模式，结果发现，B淋巴瘤细胞Raji中WDFY4的表达水平远高于其它3种细胞，表明该基因在B细胞中高表达。我们还将WDFY4的shRNA和包含BEACH-WD40结构域表达载体（由于WDFY4蛋白太大，无法构建全长的表达载体）转染细胞，氯喹处理后，免疫印迹法检测细胞自噬流。结果发现低表达的WDFY4促进了自噬流，而BEACH-WD40结构域的高表达则抑制了自噬流。
　　为了研究WDFY4抑制自噬的分子机制，我们检测了shWDFY4细胞以及BEACH-WD40结构域高表达细胞中，自噬相关蛋白的表达水平。结果发现，低表达WDFY4的细胞中，Bcl2表达水平下调;而高表达BEACH-WD40结构域的细胞中，Bcl2表达水平升高。Bcl2是一个抗凋亡蛋白，它的高表达会抑制细胞凋亡。另外，Bcl2可以与自噬蛋白Beclin1相结合，使参与自噬的Beclin1蛋白减少，从而抑制细胞自噬。由于过度自噬也可能导致细胞自噬性死亡，所以Bcl2可能直接抑制细胞凋亡，也可能抑制细胞自噬性死亡。
　　接下来，我们用流式细胞术的方法，检测了低表达的WDFY4和高表达的BEACH-WD40结构域对细胞凋亡的影响。与预期相一致，低表达的WDFY4促进了细胞凋亡，高表达的BEACH-WD40结构域则抑制细胞凋亡。