动脉硬化关键信号分子相关的血清microRNA在亚临床甲减病人中表达谱初探

摘要

背景：
　　亚临床甲状腺功能减退症(Subclinical hypothyroidism，SCH)（简称亚临床甲减）是指血清促甲状腺激素（Thyroid-stimulating hormone，TSH）水平高于正常上限，而血清游离甲状腺激素水平FT4(free T4)及血清游离三碘甲状腺原氨酸水平FT3(free T3)在正常范围为特点的甲状腺功能紊乱。发病率随年龄增加，在普通人群中发病率约5-15％，但在74岁以上的人群中发病率达到高峰:男性约16％，女性约21％。大量的研究表明，TSH存在广泛的甲状腺外作用，尤其对血管的损伤越来越受到关注，研究表明亚临床甲减可通过脂代谢紊乱，内皮细胞功能损伤，氧化应激等诱发或加重动脉粥样硬化（atherosclerosis，ATH），是心血管疾病的潜在危险因素。但另有大型追踪研究未发现亚临床甲状腺功能减退与动脉硬化相关。到目前为止，亚临床甲状腺功能减退对动脉硬化的影响还未达成共识，存在争议。因此有必要多角度探讨亚临床甲减与动脉硬化的相关性，为亚临床甲减病人的防治工作寻找理论依据。
　　MicroRNAs(简写为miRNAs，miRs)是一组内源性、功能性的非编码小RNA片段，在转录后水平调节基因表达。miRNA稳定存在于人的体液及血液系统中，具有很好的稳定性、可重复性，能够从外周血中稳定检测，具有生物学标记的优良特点。已经证实miRNAs在包括动脉硬化等多种人类疾病中具有重要意义，而且其表达水平呈现出器官特异性及组织特异性。特定的microRNA表达谱的变化提示着体内特定的病理、生理过程。
　　本研究首次对初发亚临床甲状腺功能减退症患者中6个动脉硬化关键信号分子相关的microRNA的表达谱进行了初步探讨，从一新的角度重新为亚甲减与动脉粥样硬化的相关性进行了评估。通过文献复习，与动脉硬化发生发展过程密切相关的6个血清microRNAs纳入本研究:其中miR-21-3p可以促进血管平滑肌增殖，从而促进动脉粥样硬化;miR-125a-5p与氧化低密度脂蛋白等血管炎性反应密切相关;miR-126-3p与血管稳定性、完整性和粘附分子的表达密切相关;miR-210在缺氧状态下可促进血管增殖，是缺氧特异性microRNA;miR-221-3p及miR-222-3p具有抗血管增殖作用，抑制内皮细胞迁移，增殖，及血管生成作用。
　　研究目的：
　　①初步探讨亚临床甲减人群中动脉硬化关键信号分子相关的microRNA的表达谱变化，进一步从新的角度探讨亚临床甲减与动脉硬化的相关性。
　　②进一步分析动脉硬化关键microRNA表达水平与TSH水平、血脂水平及颈动脉内膜的相关性。
　　③探索6个血清microRNAs整体表达模式，寻找分别在亚临床甲减人群中及动脉硬化人群中最具特异性表达的microRNA。
　　研究对象与方法：
　　诊断:①亚临床甲状腺功能减退症的诊断参考国际通用标准和中国甲状腺疾病诊断指南，即TSH水平升高超过正常上限而游离甲状腺素水平包括游离甲状腺三碘原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)正常。
　　②颈动脉内中膜增厚诊断标准参照国际超声目前常用诊断标准和2010中国高血压病防治指南，即最大颈动脉内中膜厚度小于0.9毫米(max-IMT＜0.9mm)定义为正常，最大颈动脉内中膜厚度大于0.9毫米(max-IMT＞0.9mm)定义为颈动脉内中膜增厚，最大颈动脉内中膜厚度大于1.3毫米(max-IMT＞1.3mm)定义为颈动脉内膜粥样斑块形成。
　　③血脂异常的诊断标准按NCEP/ATPⅢ(the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel Ⅲ)规定的标准。
　　研究对象：健康对照人群22例(NC，n=22);单纯亚临床甲减病人20例(SCH，n=20);亚临床甲减伴有颈动脉内中膜增厚的病人21例(SCH+ATH，n=21)。颈动脉硬化不伴亚临床甲减患者22例(ATH，n=22)。
　　研究方法：搜集每个研究对象基本临床资料;超声测量颈动脉内中膜厚度;留取血标本进行生化指标即甲状腺功能检测;采用实时荧光定量PCR方法确定每个研究对象血清微小RNA的相对表达量。
　　统计分析：连续性变量数据以均数±SEM表示，非连续性分类变量以原始数据表示。变量的正态分布采用Shapiro-Wilk test进行检测。正态分布的数据采用单向方差分析(ANOVA)和LSD多重比较。非正态分布的数据进行Kruskal-Wallis test检验和Mann-Whitney U检验。性别分布采用R*C表列联分析进行比较。采用Spearman相关分析TSH，血脂，miRNAs与颈动脉内膜厚度等变量间的相关性。miRNA整体表达模式的凝聚层次聚类分析采用Cluster version 3.0和Java Treeview 1.60，采用平均欧式距离来丈量组间最近距离。基于microRNA表达水平的工作特征(ROC)曲线分析分别用于不同microRNA识别亚甲减病人和动脉粥样硬化病人的识别效力评价分析。所有数据均用SPSS13.0软件包进行统计，所有统计检验均为双侧，差异显著性水平定义为p＜0.05。
　　研究结果：
　　一般资料比较:总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯水平(TG)在SCH组，SCH+ATH组和ATH组显著高于正常对照组(p＜0.05）;SCH+ATH组患者TC及LDL-C水平显著高于单纯SCH组(p＜0.05）;而总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯水平(TG)在SCH+ATH组和ATH组无显著差异(p＞0.05）。
　　入选的6个microRNAs的相对表达量组间比较:miR-21-5p相对表达量在SCH组(1.842±0.221)、SCH+ATH组(2.447±0.102)和ATH组(1.654+0.171)患者中表达量显著高于NC组(0.912±0.274)，(p＜0.05）;在SCH+ATH组表达量显著高于SCH组和ATH组(p＜0.05）。miR210在各组间的表达丰度都极低，未见统计学差异(p＞0.05)。miR-125a-5p以及miR-126-3p从NC组(分别为0.053±0.234和1.125±0.211)到SCH组(分别为-0.732±0.206和-0.279±0.247)再到SCH+ATH组(分别为-1.895±0.220和-1.257±0.219)或ATH(分别为-2.290±0.223和-1.232±0.289)呈逐步降低的趋势(p＜0.05），但在ATH+SCH组及ATH组表达水平无显著差异(p＞0.05)。与抗血管增殖作用相关的miR-221-3p和miR-222-3p在SCH+ATH组(分别为-2.466±0.142和-2.636±0.128)和ATH组(分别为-2.323±0.197和-2.628±0.208)，表达水平较NC组(分别为-1.276±0.160和-1.392±0.203)，(p＜0.05，p＜0.05)和SCH组(分别为-1.368±0.110和-1.563±0.125)显著下调(p＜0.05，p＜0.05)，而在正常组(NC)和亚临床甲减组(SCH)之间以及ATH组和SCH+ATH组之间不存在显著差异(p＞0.05，p＞0.05)。
　　相关分析:log2mir-21-5p与TSH水平和max-IMT（最大颈动脉内中膜）呈正相关，与血脂水平无明显相关。log2miR-125a-5p、log2miR-126-3p、log2miR-221-3p和log2miR-222-3p均与血脂水平、TSH水平和颈动脉内膜厚度呈现负相关。log2miR-210与血脂水平、TSH水平以及颈动脉内膜厚度之间未发现相关性。
　　基于差异表达的5个血清目标miRNA分层凝聚聚类分析:结果显示基于差异表达的5个血清目标miRNA分层凝聚聚类分析可将各组大部分个体聚在一起，22个正常人(NC)中16个聚在一起;20个SCH患者15个聚在一起;21例SCH+ATH患者中16个聚集在一起以及22例ATH病人中18例聚在一起。
　　ROC曲线分析显示:miR-21-5p在识别亚临床甲减病人时曲线下面积AUC:0.762(95％CI，0.658-0.865)，在6个目的microRNA中最大。而miR-126-3p在识别所有动脉硬化病人时曲线下面积AUC:0.888(95％CI，0.819-0.958)，在6个目的microRNA中最大。
　　结论：
　　①动脉硬化关键病理生理过程相关的血清微小RNA在亚临床甲减病人中存在特异性表达异常，并且与TC、TG、LDL-C、TSH水平和动脉内膜厚度存在相关性。
　　②MicroRNA-21-5p在亚临床甲减病人中及动脉硬化病人中均存在表达上调，但在亚临床甲减病人中表达最具有特异性
　　③MiR125a-5p、miR-126-3p、miR-221-3p及miR-222-3p表达下调与动脉粥样硬化密切相关，其中miR126-3p在动脉粥样硬化患者中表达最具有特异性。