促甲状腺激素增加肝脏甘油三酯含量的机制研究

摘要

研究背景:
　　非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种无过量饮酒史、肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。疾病谱随病程的进展表现不一，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬变4个病理类型。脂肪性肝炎和纤维化可以直接或间接地加速并存的肝脏疾病的进展，从而导致肝硬化或肝癌。NAFLD与代谢综合征、糖代谢异常、糖尿病密切相关，多项前瞻性研究证实，NAFLD可预测2型糖尿病和心血管疾病的发病率和死亡率，严重危害人们生命健康。近年来，非酒精性脂肪肝的发病率逐年增加，根据地区不同，NAFLD在一般人群患病率为9％～36.9％，美国NAFLD患病率为20％。随着NAFLD病因学研究的深入，除了传统的NAFLD危险因素如BMI过高、高血脂症、糖尿病和35～50岁年龄段等因素外，内分泌激素的影响如生长激素缺乏、性腺功能减退、垂体功能减退、多囊卵巢综合征、高皮质醇血症、甲状腺功能减退等，在NAFLD的发病过程中起了重要的作用。
　　亚临床甲状腺功能减退症(subclini calhypot hyroidism，SCH)，是指血清促甲状腺激素水平升高而游离甲状腺素维持在正常参考值范围内，简称亚甲减，是甲状腺功能减退的早期阶段。临床资料提示TSH与NAFLD患病率存在正相关。NAFLD患者血清TSH水平明显高于正常对照，亚甲减患者其NAFLD患病率较正常甲功者明显增加(29.9％vs19.5％);亚甲减是预测NAFLD发生的独立危险因素，危险度(95％CI)为2.21(1.42-3.44)。临床资料显示亚甲减患者血甘油三酯(TG)水平升高。由于TSH是SCH患者唯一发生改变的甲状腺功能指标，我们的研究将从体内、体外水平研究TSH是否能增加肝细胞内脂质蓄积，及其相关的分子机制。
　　肝脏是人体最大的内脏器官，在调节机体TG代谢方面起中心作用。肝细胞脂肪变是NAFLD的标志之一，组织学观察标准为5％以上的肝细胞出现脂肪变即可认定为NAFLD。肝脏脂滴主要是由甘油三酯组成。固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是3个调节脂代谢的主要核转录因子的总称。其中SREBP-1c直接参与调控有关脂肪酸和甘油三酯合成相关酶基因的表达，是脂肪合成基因的主要转录调节因子。SREBP-1c调节的靶基因包括低密度脂蛋白(LDL)受体、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、S14、葡萄糖激酶(GK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP-CK)等有关脂肪合成和葡萄糖代谢的基因。SREBP-1c在脂肪肝病理过程中的作用已被多种模型证明。在人脂肪肝标本中，SREBP-1c表达量较正常肝脏增加5倍。SREBP-1c的量主要受到三方面的调节:转录水平的调节、SREBP-1c前体蛋白转化为成熟体蛋白时的蛋白裂解过程的调节、成熟体SREBP-1c（nSREBP-1c）的翻译后修饰调节，其中，SREBP-1c的转录水平的调节被认为是其主要的调节形式。
　　过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是目前研究最广泛的核受体，近来研究表明，PPARα也参与了脂肪酸的从头合成。研究表明，PPARα是SREBP-1c活性的重要调控因子。非诺贝特喂养的的小鼠，其肝脏前体和成熟体SREBP-1c表达量明显增加，FASN、ACC1、SCD1等SREBP-1c的下游分子表达量随之增加;PPARα敲除的小鼠，其脂肪酸合成下降，肝脏中SREBP-1cmRNA和蛋白表达量较野生型小鼠均明显降低;PPARα可以直接结合SREBP-1c启动子区域，诱导其表达。
　　本研究以肝脏甘油三酯合成的关键调控分子SREBP-1c为切入点，围绕TSH调控其表达的主要信号通路及交汇组成的网络进行研究:分别通过体内研究（Tshr基因敲除小鼠，非诺贝特喂养小鼠，forskolin腹腔注射小鼠及H89腹腔注射小鼠）与体外细胞水平研究（多种属的肝原代细胞和肝细胞株），论证cAMP/PKA/PPARα/SREBP-1c信号通路在此调控过程的地位和作用，阐明TSH对肝脏甘油三酯合成过程的影响，揭示亚临床甲减致NAFLD的分子机制。为探究TSH导致脂肪肝的分子机制提供新的观点;在医学实践上为NAFLD提供新的治疗思路和策略。
　　目的:
　　1.前期研究已证明肝细胞膜上表达功能性TSH受体(TSHR)，本课题拟通过研究TSHR介导的TSH作用，上调肝细胞SREBP-1c表达，增加肝细胞内总甘油三酯含量，促进肝脏脂肪变及NAFLD的发生，从而揭示TSH在甘油三酯合成中的可能作用，揭示亚临床甲减致NAFLD的分子机制。
　　2、通过TSH刺激肝细胞cAMP/PKA/PPARα信号途径的实验研究，揭示TSH增加肝细胞SREBP-1c的表达的作用机制。
　　3、PKA、PPARα和SREBP-1c等分子在此调控过程中居于核心地位和发挥关键作用。
　　研究方法:
　　1、细胞培养:1）肝细胞系人肝癌细胞HepG2均按培养条件要求培养。2）小鼠原代肝细胞采用原位二步灌注法，接种于预铺鼠尾胶原的6cm培养皿，置37℃5％CO2条件下培养，每24小时换液。待细胞长至70％～80％时，弃去原完全培养液，PBS洗两遍，以无血清培养液培养过夜后再添加相应处理，以排除血清中脂蛋白及各种激素对实验的干扰作用。
　　2、动物模型:Tshr基因敲除小鼠（普通喂养及高脂喂养），菲诺贝特喂养C57BL/6J小鼠，PPARα基因敲除小鼠（非诺贝特喂养），forskolin腹腔注射小鼠及H89腹腔注射小鼠。
　　3、油红染色、H&E染色及电镜观察细胞内脂质沉积情况。
　　4、肝细胞内及血清TG测定采用TG检测试剂盒（北京普利莱公司），实验操作按照说明书进行定量测定。
　　5、采用RT-PCR检测PPARα、SREBP-1c及其分别的下游分子、TG合成相关基因mRNA的表达。
　　6、采用WesternBlotting检测PPARα、SREBP-1c前体及成熟体蛋白水平变化。
　　7、采用免疫荧光及免疫组化方法检测PPARα、SREBP-1c在肝组织及细胞中的表达及分布。
　　8、化学合成siRNA干扰实验检测指标:特异性针对SREBP-1c或PPARα等干扰后，相应分子及其下游分子的代谢关键酶及相应调控因子在mRNA及蛋白水平的变化。
　　9、重组质粒转染实验检测指标:转染DN-SREBP-1c显性负性失活突变质粒后，信号通路相应分子的变化及相应调控因子在mRNA及蛋白水平的变化。
　　10、荧光素酶活性分析检测指标:含有PPARα结合位点的SREBP-1c启动子区域重组质粒荧光素酶活性分析。
　　11、免疫共沉淀实验(co-IP)检测指标:磷酸化PPARα表达。
　　12、血脂及肝功测定检测指标:血脂（总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇）;肝功（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素）。采用OlympusAu5400全自动生化分析仪（山东省立医院检验科）检测。
　　13、血清TT4，TT3，TSH水平的测定收集待测血清，采用放免法按照试剂盒要求进行操作。
　　14、采用SAS系统和SPSS17.0统计软件分析实验数据。主要有如计量资料采用(x)±s做描述，多组均数比较采用方差分析，方差不齐的采用Kruskal-Wallis秩和检验。
　　结果:
　　1、TSH增加肝脏甘油三酯聚积，促进肝脏脂肪变
　　TSH能剂量和时间依赖性地增加HepG2细胞内脂滴含量;TSH处理细胞48h，能剂量依赖性地增加细胞内甘油三酯含量。高脂喂养20周后，野生型小鼠肝脏呈油腻灰黄状，而Tshr-/-小鼠肝脏形态相对正常;油红染色显示，野生型小鼠肝脏脂滴含量较Tshr-/-小鼠明显增加;Tshr-/-小鼠肝脏甘油三酯含量明显减少(P＜0.05)。即使普通饮食喂养的小鼠，Tshr-/-小鼠肝脏脂滴含量和甘油三酯含量也明显减少(P＜0.05)。
　　2、甘油三酯代谢相关基因表达改变
　　我们在Tshr-/-小鼠肝脏中检测了参与TG从头合成(FASN、ACC1、SCD1、DGAT2、GPAT1)、脂肪酸β氧化(CPT1α)、脂肪酸摄取(FABP)、VLDL输出(ApoB、MTPF)等相关基因的表达。TSHR敲除对TG代谢的各个环节均发生了影响，其中以TG从头合成(DNL)相关基因表达下降最为显著，且DNL调节最重要的分子SREBP-1cmRNA表达量明显下降(P＜0.05)。
　　3、SREBP-1c在TSH调节TG合成中的中心作用
　　Tshr-/-小鼠肝脏中SREBP-1c前体及成熟体蛋白表达量均较野生型小鼠明显降低。在肝细胞系中，SREBP-1c及其下游直接调控分子表达量呈TSH剂量依赖性增加(P＜0.05)。用SREBP1-siRNA或DN-SREBP-1c抑制SREBP-1c表达后，TSH的上述作用消失。
　　4、PPARα激活促进SREBP-1c表达，增加肝脏甘油三酯含量
　　非诺贝特喂养的小鼠肝脏甘油三酯和SREBP-1表达均较对照组小鼠增加，呈非诺贝特剂量依赖性（P＜0.05）。在肝细胞系中，非诺贝特能剂量依赖性增加细胞内甘油三酯含量和SREBP-1c表达。在细胞中用siRNA下调PPARα表达后，SREBP-1c表达相应减少。非诺贝特处理能剂量依赖性激活SREBP-1c启动子转录功能，使荧光素酶活性明显增加。
　　5、PPARα介导TSH对SREBP-1c的调节，且PKA可使PPARα磷酸化激活
　　Tshr-/-小鼠肝脏中PPARαmRNA、蛋白表达量均较野生型小鼠明显降低(P＜0.05)。在肝细胞系中，PPARα及其下游直接调控分子表达量呈TSH剂量依赖性增加(P＜0.05)。腺苷酸环化酶(Adenylylcyclase，AC)的特异性激活剂Forskolin注射小鼠，肝脏SREBP-1c、PPARα表达量均较野生组增加;而PKA的特异性抑制剂H89注射小鼠可减少肝脏SREBP-1c、PPARα表达。用PPARα特异性抑制剂MK886抑制PPARα活性后，TSH引起的SREBP-1c表达增加及SREBP-1c启动子区域荧光活性增加均被抑制。co-IP证实PKA可通过增加PPARα磷酸化从而增加其活性。
　　结论:
　　1、TSH增加肝脏甘油三酯聚积，促进肝脏脂肪变;
　　2、TSH对甘油三酯代谢的各个环节均发生了影响，其中对TG从头合成相关基因表达的影响最为显著;
　　3、TSH调控甘油三酯合成代谢过程主要是通过cAMP/PKA/PPARα信号通路实现的，且PKA、PPARα和SREBP-1c等分子在TSH调控甘油三酯合成代谢过程中居于核心地位和发挥关键作用。