中枢神经系统损伤后谷氨酸的神经细胞毒性作用的机理研究

摘要

背景:L-谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经传导递质，主要位于大脑皮层和海马等部位。当谷氨酸病理性升高时，其作为一种神经毒素可以诱导严重的神经元损伤，谷氨酸介导的神经细胞的过度激活或谷氨酸的过度刺激都将引起细胞的死亡，这种病理过程被称为谷氨酸的神经毒性。近年来的研究发现谷氨酸的神经毒性伴随着线粒体膜电位的下降以及细胞内活性氧的过度生成，这些线粒体功能障碍指标提示谷氨酸的神经毒性与线粒体功能可能存在联系。
　　线粒体是一种高度动态的细胞器，通过不断的分裂融合保持线粒体动力学稳态。最近研究发现当这种稳态被破坏时会影响到线粒体正常的功能，趋向于分裂导致线粒体碎片产生，线粒体缩短;相反趋向于融合时导致线粒体变长。线粒体的融合/分裂运动主要被一系列线粒体融合/分裂蛋白调控。这些蛋白主要包括了:分裂蛋白:.dynamin-like protein1（DLP1，也叫Drp1），以及它的作用因子包括Fis1，Mff, MiD49 and MiD51;融合蛋白:Mitofusin1(Mfn1)，Mitofusin2(Mfn2)以及optic atrophy protein1(OPA1)。这些蛋白除了调控线粒体的形态，也在线粒体功能正常运行的各个环节上有重要的作用。因而顺理成章，目前已有很多研究表明线粒体的分裂/融合稳态的改变可以导致线粒体的功能障碍，引起相关神经疾病。
　　目的:通过对大鼠原代神经细胞，谷氨酸灌注小鼠模型，转基因小鼠，人体标本的研究，探索谷氨酸的神经毒性信号通路，然后找到并证实介导谷氨酸神经毒性的关键蛋白，最终在细胞内，细胞外，动物模型以及人体上阐明并证明谷氨酸的神经毒性机理以及信号通路。
　　方法和材料:抗体、质粒、化学试剂及测量方法
　　购买或获得质粒:MitoDsRed2(Clontech公司，Mountain View, CA)，Case12construct(来自Evrogen公司，Moscow, Russia)，GFP-Cre(来自Addgene公司，Cambridge MA)以及GFP/Myc-tagged Mfn2（斯坦福大学提供）.通过neomycin/kanamycin抑制基因在MitoDsRed2序列中利用核定位信号(GFP-Cre质粒中的NLS-Cre)增加Cre序列成功构建MitoDsRed2/Cre双启动子质粒.克隆mitoDsRed2并导入pLVX-Puro(Clontech公司，Mountain View, CA)质粒用NLS-Cre替代puromycin抑制基因成功构建MitoDsRed2/Cre双启动子慢病毒。利用第三代慢病毒包装盒(包装系统:pMDLg/pRRE和pRSV-Rev;包裹质粒:Addgene公司，Cambridge MA的pMD2.G)成功制备慢病毒。得到数据后，裂解细胞并测定细胞总蛋白，氧消耗量根据总蛋白不同进行标准化量化。通过Cytotoxicity Detection试剂盒(LDH; Roche公司，Nutley,NJ)或CellProliferation试剂盒(MTT法;Roche公司，Nutley,NJ)测定细胞死亡和生存率。通过细胞普罗匹定碘化物测定神经细胞存活率。带有普罗匹定碘化物阳性细胞核或者可见的细胞核碎片或神经突碎片的神经细胞计作坏死神经细胞，而普罗匹定碘化物阴性的细胞核并且具有完整的神经细胞核轮廓或者神经突的神经元计为存货细胞。
　　原代神经细胞的分离
　　原代神经细胞分离（应用大鼠脑组织或胚胎或）利用鼠Thy-1.2基因表达盒将Thy1-Mfn2注射入C57BL/6N鼠受精卵内成功构建mfn2过表达小鼠。根据美国动物保健和使用委员会(IACUC)制定的指南处理适宜怀孕时间的Sprague-Dawley母鼠（大鼠）(Harlan or Charles River)或者C57BL/6N母鼠（小鼠），成功从E13-15母鼠（大鼠）/E12-14母鼠（小鼠）胚胎中分离原代运动神经细胞，从E18母鼠（大鼠）胚胎中分离原代神经细胞。
　　线粒体的纯化及蛋白质印记分析
　　在细胞中加入1xLysis buffer(Cell Signaling公司，Danvers，MA)和1 mMPMSF(Sigma公司，St.Louis，MO)以及蛋白酶抑制剂(Sigma公司，St.Louis，MO)提取总蛋白.用SDS-PAGE溶解同样体积的总蛋白然后转到Immobilon-P(Millipore公司，Billerica, MA)膜.10％的脱脂牛奶封闭后,用一抗二抗进行孵育，蛋白膜用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore公司，Billerica，MA)显影剂进行显影曝光.
　　谷氨酸灌注小鼠动物模型的建立
　　所有小鼠的手术及手术过程严格按照美国NIH指南进行，并且依据动物护理及使用协会IACUC的规定进行操作。迷你渗透性泵(2001模型，Alzet公司，Cupertino，CA;液体泵速率1μl/小时)接入2cm的大脑注入管(脑注入盒，Alzet公司，Cupertino，CA)并在其中分别泵入模拟脑脊液aCSF(成分:124 mM NaCl，25 mMNaHCO3,10 mM D-glucose,2.5 mM KCl,1 mM MgCl2,2 mM CaCl2和1mMNaH2PO4，并用NaOH调节pH到7.2-7.4)或者aCSF溶解10mM谷氨酸。并依据使用说明在37度环境下通宵注射药物。
　　小鼠中枢神经系统的免疫组织化学和免疫荧光检测成功构建免疫荧光小鼠，以便于利用线粒体特征蛋白Tom20和VDAC1更好的观察运动神经细胞内线粒体的形态。简要介绍过程如下:用蒸馏水冲洗3次组织切片放置于1x抗原decloaker(Biocare公司，Concord，CA)试剂中。在22psi气压下加热至125度10秒，然后在0 psi气压下冷却至90度30秒，利用Biocare公司的Decloaking Chamber高压锅进行抗原修复。随后用10％的羊血清(NGS，St.Louis，MO)对切片封闭30分钟，并在1％羊血清的PBS中孵育一抗过夜。第二天PBS冲洗3次后用10％的羊血清孵育10分钟，然后加入荧光显影二抗(Invitrogen公司，Grand Island，NY)(1∶300)室温避光孵育2小时，最后切片用PBS清洗，用DAPI染色，再次用PBS洗3次，加入荧光介质油(Southern Biotech公司，Birmingham，AL)。
　　小鼠中枢神经系统的电镜检测
　　EM固定液(the quarter strength Karnovsky-1.25％ DMSO mixture)通过心脏灌注法输入小鼠体内5分钟后迅速取出脊髓并放置于EM固定液中室温15分钟，更换新鲜EM固定液继续固定2小时。PBS清洗后组织块用1％ osmium-1.25％ferrocyanide mixture室温固定2小时。组织切片清洗后浸泡在酸化的0.5％uranylacetate溶液中.再次冲洗后组织块在浓度依次上升的酒精中脱水，最后包裹在Poly/Bed812树脂中(Polysciences公司，Warrington，PA).较薄的切片随后用2％酸化uranyl acetate染色并用Gatan single tilt，Gatan US40004kx4k CCD电镜观察(Gatan公司，Pleasanton, CA)。
　　体外钙蛋白酶切割实验
　　100ug纯化线粒体蛋白以及1ug重组Mfn2蛋白(Origene公司，Rockville，MD)分别与人红细胞纯化u-calpain(calpain-1)(Biovision公司，Milpitas，CA)蛋白在30度孵育30分钟。以calpain-Ⅰ提前与PMSF或者calpeptin30度孵育5分钟为抑制组。最后添加含有62.5 mM Tris-HCl，4％ SDS，10％ glycerol，50 mM DTT和0.1％ bromophenol blue(pH6.8)的SDS样本液停止反应.样本经过100度10分钟变性煮沸，加入1/6的反应蛋白量进行免疫印迹分析。
　　结果:1.在神经细胞中谷氨酸可导致线粒体破裂
　　2.在神经细胞中，Mfn2的缺失可导致线粒体和神经细胞的毒性
　　3.细胞实验:Mfn2过表达可以阻断谷氨酸介导的线粒体功能障碍和神经细胞死亡
　　4.动物实验:Mfn2过表达可以保护线粒体和神经细胞免于谷氨酸所引起的细胞毒性
　　5.谷氨酸作用于神经细胞后通过激活Calpain来实现对mfn2的剪切
　　6.在人体标本中验证了谷氨酸所介导的calpain的激活，mfn2的剪切，以及线粒体的破裂
　　结论:谷氨酸介导calpain的激活剪切mfn2后，可引起线粒体功能障碍及运动障碍，最终出现谷氨酸的神经毒性并导致神经细胞的死亡。通过阻断mfn2的剪切可以在细胞模型及动物模型上阻断谷氨酸所介导的神经毒性。创新性及意义:谷氨酸的神经毒性作用广泛存在神经系统疾病中包括脑出血，卒中，脑肿瘤，中枢系统感染，并且与相关疾病的发生有密切的关系。本实验从体内到体外，从细胞模型到动物模型再到人体模型均证实了谷氨酸所介导的mfn2剪切所导致的神经毒性，意义重大，相关信号通路将可能成为未来几年的研究热点。

目录

声明

摘要

符号说明

前言及综述

第一部分 谷氨酸神经毒性对线粒体的影响

引言

材料与方法

结果

讨论及小结

第二部分 谷氨酸诱导神经毒性与线粒体动力学蛋白的关系

引言

材料与方法

结果

讨论及小结

第三部分 调节线粒体动力学蛋白能否抑制谷氨酸所介导的神经毒性?

引言

材料与方法

结果

讨论及小结

第四部分 谷氨酸介导神经毒性的信号通路

引言

实验方法

结果

讨论与小结

第五部分 在人体标本中验证谷氨酸介导神经毒性在相关疾病中的信号通路

引言

材料与方法

结果

讨论及小结

讨论总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

英文文章一

英文文章二