GLp-1抑制内皮细胞间充质化及Compound 21调控骨骼肌微循环灌注的机制研究

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述：
　　第一部分 围绕GLP-1与内皮细胞间充质化的关系及其潜在机制展开研究
　　研究背景和目的:长期糖尿病可以导致器官及组织的纤维化，例如糖尿病心肌纤维化和糖尿病肾脏纤维化。过度纤维化可以破坏器官及组织的正常结构，最终引起脏器功能紊乱及衰竭。成纤维细胞可以分泌大量的细胞外基质，高糖环境下过度增殖及活化的成纤维细胞被认为是糖尿病器官及组织纤维化的罪魁祸首。近期研究发现有相当数量的成纤维细胞是由内皮细胞转化而来，将这种现象称之为内皮细胞向间充质细胞转化(Endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)。
　　聚(ADP-核糖)聚合酶poly(ADP-ribose) polymerase，PARP是一种DNA修复酶，在调控细胞的生存、凋亡过程中发挥重要作用。正常情况下PARP-1的活性相对较低，然而在DNA损伤时PARP-1的活性迅速升高，催化相应受体蛋白的聚ADP核糖基化反应，进而参与DNA的修复。
　　Glucagon-like peptide-1(GLP-1)是由肠L细胞产生的肠促胰岛素分泌肽。越来越多的研究发现GLP-的1受体不仅表达于胰腺组织，还表达于内皮细胞、平滑肌细胞以及心肌细胞上。新近研究显示GLP-1激动剂可以显著改善高脂诱导的心功能障碍及心肌纤维化。
　　目的:1.GLP-1能否在体内及体外水平改善高糖诱导的内皮细胞间充质化。
　　2.GLP-1抑制高糖诱导的内皮细胞间充质化的相关分子机制。
　　方法:1.细胞培养及分组:
　　入主动脉内皮细胞分为72小时正常浓度葡萄糖(5 mmol/l)干预组、72小时高糖(30mmol/l)干预组、72小时高糖+PARP-1小干扰RNA组、72小时高糖+Snail小干扰RNA组、72小时高糖+GLP-1类似物组。
　　2.动物饲养及分组:
　　8周龄的C57BL/6小鼠经相应处理后分为以下三组:1.正常对照组;2.STZ诱导的1型糖尿病鼠;3.STZ诱导的1型糖尿病鼠+GLP-1(24nmol/kg/day)受体激动剂组。
　　3.心功能检测:
　　小鼠干预结束后，应用经胸壁超声心动图技术检测心功能相应指标。
　　结果:1.GLP-1治疗显著改善了STZ诱导的1型糖尿病鼠的心肌纤维化及心功能障碍
　　小鼠超声心动图显示，相对于正常小鼠，糖尿病小鼠心功能指标出现明显恶化，GLP-1类似物治疗后，心功能得到显著改善。此外Masson三色及Westemblot显示，与正常小鼠比较而言，糖尿病小鼠心肌纤维化及细胞外基质明显增加，GLP-1类似物治疗组心肌纤维化程度显著降低。
　　2.GLP-1分别在体内及体外水平抑制了高糖诱导的内皮细胞间充质化
　　3.GLP-1通过抑制ROS的产生抑制PARP-1的活化
　　Westernblot显示，GLP-1可以明显抑制高糖引起人主动脉内皮中PARP-1的活化。此外应用免疫荧光技术证实，GLP-1可以显著降低高糖诱导过度生成的ROS。
　　结论:1.GLP-1可以显著改善糖尿病心肌纤维化和心功能障碍。
　　2.GLP-1可以在体内及体外水平显著逆转高糖诱导的内皮细胞间充质化。
　　3.GLP-1下调高糖诱导的内皮细胞间充质化可能与抑制PARP-1的活化有关。
　　意义:高糖可以引起内皮细胞的间充质化，进而促进心肌组织纤维化，导致心功能恶化。GLP-1受体类似物可以通过下调PARP-1的活性显著逆转高糖诱导的内皮间充质化，进而改善心肌纤维化及心功能。因此研究为未来糖尿病器官纤维化的治疗提供了新的思路及理论支持。
　　第二部分 围绕Compound21能否扩张骨骼肌微循环进及其潜在机制展开研究，
　　背景和目的:胰岛素经内皮向骨骼肌间隙的转运是影响骨骼肌对葡萄糖摄取的“限速步骤”。有研究证实，增加骨骼肌微循环再灌注(microvascular recruitment)，可以增大肌肉毛细血管床交换面积，进而促进胰岛素经内皮向骨骼肌间隙转运，最终增加骨骼肌对葡萄糖的利用。在胰岛素抵抗环境下（如肥胖，2型糖尿病等），胰岛素介导的骨骼肌微循环再灌注出现严重障碍，这一障碍限制了胰岛素经内皮向骨骼肌间隙转运，最终加重外周胰岛素抵抗。因此骨骼肌微循环系统已成为治疗胰岛素抵抗的新作用靶点。
　　肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是人体内重要的体液调节系统。该系统在维持身体人体血压及电解质平衡方面发挥极为重要的作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是该系统中重要的组成部分，该因子可以通过结合2种G蛋白偶联受体(血管紧张素1型受体(Angiotesin type1receptor，AT1R)和血管紧张素2型受体(Angiotesin type2 receptor，AT2R))发挥相应的血管效应。例如在阻力血管(Resistance vessels)中， AngⅡ与AT1R相结合可以引起阻力血管的收缩以及平滑肌的增殖，AngⅡ与AT2R相结合则可通过激活下游的缓激肽/一氧化氮（bradykinin/NO）通路引起阻力血管的舒张进而对抗1型受体介导的缩血管作用。目前大多数研究主要集中在AngⅡ对大血管的调节作用，其对微循环系统的调节及其机制尚不清楚。早些时候Nora等研究发现，在骨骼肌微循环系统上普遍存在着血管紧张素1型及2型受体。此外，前期研究发现，持续小剂量(1 ng/kg/min)静脉输注血管紧张素Ⅱ可以在不引起血压变化前提下增加骨骼肌微循环再灌注。上述研究结果充分说明血管紧张素Ⅱ在调节骨骼肌微循环再灌注过程中发挥重要作用。
　　Compound21是近年来新开发的一种高选择非肽类血管紧张素2型受体激动剂，既往研究证实，持续静脉输注Compound21并不能降低正常SD大鼠的平均动脉血压，只有在与血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂联合应用时才能发挥其降压效应。近期研究发现，持续静脉输注Compound21虽然未影响血压的变化，却可以明显增加局部组织（如肾动脉）的血流，且增加的幅度与性别密切相关。因此结合上述研究结果，提出假设应用Compound21可以在不改变血压的前提下增加骨骼肌微循环再灌注。
　　目的:1.Compound21能否增加骨骼肌微循环再灌注。
　　2.Compound21是否通过AT2R/NO途径增加骨骼肌微循环再灌注。
　　方法:1.动物饲养及分组
　　将体重220-350g的成年雄性SD大鼠，置于22士2℃C无菌饲养室喂养，饥饿过夜后用于实验。大鼠分为以下4组:1.盐水对照组;2.Compound21(300ng/kg/min)持续静脉注射组;3.Compound21加AT2R拮抗剂PD123319(50μg/kg/min);4.Compound21加一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(50μg/kg/min)组。
　　2.麻醉及手术
　　Inactin于腹腔内注射麻醉，之后将大鼠取仰卧位置放于操作台上，将加热垫置于其背部，以保证在整个实验过程中大鼠的体温在生理范围内。于颈部行正中切口，用镊子钝性分离肌肉和筋膜，然后暴露气管，切开气管并插入通气导管。分离两侧颈外静脉及颈动脉，置入导管。颈动脉插管连接到动态血压监测器上。左侧颈外静脉的插管用于之后实验的相应药物输入，右颈外静脉插管用于实验过程中超声造微球造影剂的输入。手术完成后，等待60分钟，以保证大鼠麻醉状态的稳定。
　　3.动态监测骨骼肌间隙氧分压
　　应用光导纤维氧检测系统动态监测骨骼肌间隙的氧分压。将氧分压感受器的针头插入大鼠右大腿内收肌及半膜肌的肌间隙中，之后轻轻推出带有氧敏感探头的玻璃纤维，使其轻轻进入到肌间隙中，稳定30分钟。实验开始后每10秒钟记录1次氧分压的数值，每分钟取均值。
　　结果:1.Compound21增加呈浓度依赖性增加内皮细胞eNOS磷酸化
　　应用浓度梯度的(10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l、10-4mol/l) Compound21及insulin(10nmol/l)干预大鼠原代主动脉内皮30分钟，Westernblot结果显示Compound21在10-6mol/l浓度，可以显著增加eNOS磷酸化。
　　2.超生理剂量的Compound21通过AT2R非内皮依赖途径舒张远端隐动脉环
　　3.Compound21在未影响血压的前提下增加骨骼肌微循环的再灌注及骨骼肌间隙氧分压。
　　结论:1.Compound21在未影响血压的前提下增加骨骼肌微循环的再灌注及骨骼肌间隙氧分压。
　　2.Compound21介导的骨骼肌微循环再灌注效应可能是通过AT2R/NO途径实现的。
　　意义:应用Compound21直接激活骨骼肌微循环系统的血管紧张素2型受体从而扩张骨骼肌微循环，进而开放更多毛细血管床，增大血液及组织间隙的交换面积。因此具有促进胰岛素向骨骼肌间隙转运，增加胰岛素敏感性的潜在价值。这一发现为胰岛素抵抗的治疗提供了新思路及理论支持。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：GLP-1抑制高糖诱导的内皮细胞向间充质细胞转化的机制研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

附图

参考文献

第二部分：血管紧张素2型受体激动剂Compound 21调控骨骼肌微循环灌注的机制研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

附图

参考文献

英文论著Ⅰ

英文论著Ⅱ

致谢

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