利用19F-NMR对β-arrestin1标记并检测构象变化

摘要

生物科学技术日益发展的今天，我们对生物大分子结构的研究变得更加的深入。大分子结构研究中的重点之一就是蛋白质的构象变化。蛋白质构象变化包括氨基酸侧链和结构域的摆动，时间尺度从皮秒到秒，在这个过程中蛋白质会有许多中间过渡态，这种中间过渡态对于研究蛋白质的功能及药物设计有着重要的作用。一般结构研究的手段是X射线衍射(X-ray Crystal logrpahy)、电镜技术(Electro-Microscopy)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)技术。X射线晶体衍射以及电镜技术只能捕捉到最稳定的几种构象，不能够揭示蛋白构像变化过程中的其他过渡状态，以及各个状态的功能，同时X射线衍射需要摸索结晶条件，电镜技术则需要形成一个体积很大的复合物才能进行观察，对样品的制备的有较高的要求。19FNMR是在一定时间尺度上研究蛋白质运动和酶活机制的非常有力的工具。由于19F自然界100％的天然丰度，除了牙齿的氟磷酸钙，在生物体内不存在任何背景。同时19F对周围化学环境敏感，化学位移范围广，因此可以看到生物大分子更细微的结构变化，以及动态变化过程。荧光共振能量转移技术也是一种应用广泛的分子定位和构象变化检测技术，荧光共振能量转移淬灭技术可以观察两个分子在10nm左右的距离变化。
　　目的:1，合成一种敏感的能够对蛋白质构象变化进行检测的19F探针，并将探针通过非天然氨基酸编码的方法标记在beta-arrestin1上。2，用这种19F探针观察beta-arrestin1在激活和非激活状态下构象的变化。
　　方法:我使用酪氨酸酚裂解酶合成二氟代酪氨酸，并且使用基因密码子扩展技术将二氟代酪氨酸在原核表达体系中插入到beta-arrestin1中。利用代谢插入途径对iLOV蛋白进行19F标记。并用液相NMR对蛋白的19F-NMR信号进行了检测。
　　结果:1，合成二氟代酪氨酸，将二氟代酪氨酸插入到beta-arrestin1蛋白中并且进行了严谨的鉴定工作。2，观察到了二氟代酪氨酸插入beta-arrestin1后，在不同构象状态下的化学位移变化。3，观察到了激活状态和非激活状态beta-arrestin1的C末端尾巴的变化。
　　结论:1，二氟代酪氨酸是检测结构变化的一个良好探针，他的氟谱化学变化与晶体结构中发现的位移变化一致。2，Beta-arrestin1的C末端尾巴在未激活状态下，主要藏在beta-arrestin1中。但是在激活状态下，会发生较大的构象变化。我们利用19FNMR技术检测到该变化的动态过程。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．氟化学和生物学

2．氟的生化和医学应用

3．氟的代谢插入

4．基因密码子扩展技术插入

5．七次跨膜受体与arrestin介导的通路

实验材料和方法

1．实验材料

1．1 主要实验试剂

1．2 主要仪器和设备

1．3 序列

2．实验方法

2．1 基因克隆

2．2 酪氨酸酚裂解酶的表达

2．3 酪氨酸酚裂解酶的纯化

2．4 TPL(酪氨酸酚裂解酶)合成非天然氨基酸实验

2．5 二氟代酪氨酸等酪氨酸类似物纯化实验

2．6 荧光标记步骤

2．7 分子排阻层析

2．8 核磁样品准备

2．9 大肠杆菌基因敲除实验

结果

1．酪氨酸酚裂解酶工作

1．1 酪氨酸酚裂解酶载体构建

1．2 酪氨酸酚裂解酶试表达

1．3 酪氨酸酚裂解酶 酶活测定

2．酪氨酸酚裂解酶合成二氟代酪氨酸

2．1 二氟代酪氨酸的合成

2．2 二氟代酪氨酸的纯化

3．二氟代酪氨酸生物功能应用

3．1 在beta-arrestin1蛋白中试插入二氟代酪氨酸

3．2 二氟代酪氨酸对beta-arrestin1构象变化与化学位移的关系

3．3 二氟代酪氨酸对beta-arrestin1构象变化的上的应用

4．荧光淬灭方法验证beta-arrestin1构象变化

4．1 分子构建

4．2 荧光标记预实验

5．代谢插入氟代色氨酸实验

5．1 色氨酸缺陷菌株的制备

5．2 色氨酸缺陷菌株验证

5．3 使用代谢插入，在iLOV上插入氟代色氨酸

讨论

1．酪氨酸酚裂解酶的应用

2．二氟代酪氨酸的化学位移与蛋白质构象变化的关系

3．二氟代酪氨酸在检测beta-arrestin1结构变化的应用

4．通过荧光淬灭实验，验证核磁实验的正确性

5．氟代色氨酸的代谢插入

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

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