钙离子释放激活钙通道调节分子1参与蜕皮激素诱导的钙内流

摘要

背景、科学问题和研究意义：
　　钙离子是一种十分重要的信号分子，它参与调节生物各种生理活动，包括细胞分裂生长、程序性死亡、组织分化和发育等。钙离子水溶性较差，因此细胞中自由的钙离子浓度被严格控制在大约100nM的极低水平，而胞外钙离子浓度可以达到1mM。在信号来临时，钙离子通过钙通道从内质网释放或从细胞外进入，结合钙调蛋白并激活钙调蛋白激酶，调控基因表达。而进入细胞的钙离子通过钙泵被储存在内质网中或排除胞外。生物体内主要有3类钙离子通道，包括电压门控钙通道、受体控制钙通道和钙库控制钙通道。其中，钙库控制钙通道又称为储存调控型钙离子通道（store-operated calcium channel，SOC）是非神经兴奋性细胞中的钙通道，在细胞接收信号后由磷脂酶产生三磷酸肌醇（inositol1，4，5-triphosphate，IP3），IP3结合内质网上的IP3受体(IP3R)，导致细胞内质网中储存的钙离子排空，内质网膜上的Stim蛋白感受到内质网中钙离子减少发生聚集，与细胞膜上的钙离子通道Orai结合使Orai开放，使细胞外的钙离子流入到细胞内。钙离子在昆虫的变态发育中起到重要作用，在变态期，钙离子主要受到20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)的调控。前期研究发现20E调控细胞内钙离子增加，但调控机制不清楚。本文主要研究了Orai1是否参与了20E诱导的钙流动，若是参与，它的开放机制又是什么，对昆虫的生长发育又产生什么影响。本研究有助于了解20E调控的钙离子加的机制，进一步揭示昆虫的生长发育机理，为害虫的防治提供新的靶标基因。
　　结果：
　　棉铃虫是一种完全变态的鳞翅目夜蛾科昆虫，我们以棉铃虫幼虫和表皮细胞系为研究材料，通过激素刺激和干扰、细胞系上过表达等方法，探索了Orai1在棉铃虫的虫体生长发育中的作用，并探明了20E所诱导的钙离子流动的钙通道的类型，并初步了解了Orai1的开放激活机制。以下是研究的结果:
　　在虫体中，Orai1的表达量在变态期达到峰值，20E在虫体和表皮细胞系均可以诱导Orai1的基因高表达;而在虫体中干扰Orai1可以影响棉铃虫的变态，推迟棉铃虫的化踊时间;在虫体和表皮细胞系中干扰Orai1可以抑制20E下游的基因的表达。结果说明Orai1受到20E调控并参与变态。20E诱导的钙离子增加有内钙释放和外钙内流两个峰，用IP3受体的抑制剂处理细胞后，钙离子的两个钙峰均下降。表皮细胞系上干扰Orai1后，20E诱导的钙峰的第二个峰受到抑制。说明20E诱导的钙离子内流是Orai1介导的SOC型钙离子内流。在表皮细胞系上单独过表达Orai1或Stim1，20E诱导的钙流峰并没有明显变化，而同时过表达Orai1和Stim1后，20E诱导的钙流峰大幅上调，说明Orai1需要Stim1来激活钙离子流。在表皮细胞系中共转染Orai1-GFP和Orai1-RFP，利用免疫共沉淀实验，可检测到二者有相互作用，而20E刺激后，两者的相互作用量明显上调;20E的上调作用可以被GPCR的抑制剂和PLC的抑制剂所抑制，干扰掉ErGPCR1、PLCG1和Stim1也可以抑制这种上调作用。说明Orai1至少是以二聚体存在，20E可诱导Orai1的聚集和开放。
　　结论：
　　通过以上实验结果可以得出结论:20E诱导的钙离子内流是一种Orai1所介导的SOCE，并由，Orai1通过聚集来开放。
　　创新点和意义：
　　本研究揭示了20E诱导的钙离子增加是Orai1介导的SOCE;丰富和完善了20E调控途径;阐明了Orai1在昆虫生长发育中的作用，并为害虫控制提供了新的靶标分子。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

一、概述

二、钙离子通道

1．钙离子的功能

2．细胞内钙离子平衡及调控

三、SOCE型钙离子通道

1．SOCE

2．Orai蛋白家族

3．Orai的开放

四、昆虫的蜕皮激素调控

1．20E的基因组调控途径

2．20E的非基因组调控途径

五、本论文的研究内容及研究意义

第二章 Orai1介导20E非基因组途径中的钙离子内流

一、引言

二、材料和方法

1．实验材料、试剂和仪器

2．实验方法

三、结果

1．Orai1序列基因克隆及序列分析

2．Orai1的mRNA在棉铃虫的变态期高表达并且受到20E的调控

3．虫体上干扰Orai1可以延迟化蛹并且下调20E通路的基因表达

4．Orai1通过SOCE介导20E诱导的钙离子内流

5．Orai1定位于细胞膜上，受到20E刺激不发生移位

6．Orai1需要Stim1来介导20E诱导的钙离子内流

7．20E诱导Orai1发生聚集

四、讨论

1．20E通过诱导钙离子水平变化调控下游生理活动

2．20E诱导的钙离子水平变化是一种SOCE

3．Orai1需要Stim1来介导钙离子水平变化

五、结论

论文创新点总结

参考文献

致谢

在读期间发表文章