筛选类风湿关节炎中糖代谢关键基因的研究

摘要

目的：类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种自生免疫性疾病，主要出现滑膜炎症、血管翳形成和随后的关节损伤等病理改变。
　　糖代谢是机体内最主要的代谢途径之一，主要是指葡萄糖在降解的过程，包括糖酵解、有氧氧化和磷酸戊糖代谢途径。糖酵解参与是氨基酸、脂类、核苷酸类三大代谢，并能产生三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)。糖代谢不仅为机体提供能量，还通过信号通路，信号网络来调节多种生理过程。糖代谢在糖尿病、中风、精神分裂症和药物滥用等疾病中发挥重要作用。
　　有研究表明，糖代谢包括糖酵解这一过程，在RA的发病机制和发生发展中起着重要作用。有研究认为，糖酵解活动增强，在RA的发病机制中，可能发挥着重要作用。既往主要是从免疫学和遗传学的角度进行研究RA的相关致病机制，对于糖代谢如何参与影响RA发生发展尚无深入研究。而能否从糖代谢角度思考RA这一过程，我们的很多研究成果和最近的研究都提供了新的视角。
　　PCR Array是一项敏感和可靠的基因表达分析技术，不仅具有实时荧光定量PCR技术较好的准确性和灵敏度，同时还具有微列阵的高通量优势，可以进行信号转导途径、生理过程或与疾病相关的一组基因网络分析。本研究利用PCRArray法检测胶原诱导型关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠的糖代谢相关基因，旨在检测糖代谢的关键酶在RA中的表达水平改变，并阐明作用，进一步探索糖代谢在类风湿性关节炎的作用.进一步探讨糖代谢和类风湿关节炎的相关性。
　　方法:取牛Ⅱ型胶原诱导大鼠（CIA组）和正常对照大鼠(NCR组)膝关节滑膜组织，提取总RNA，采用Rat Glucose Metabolism RT2 ProfilerTM PCR Array筛选表达不一致基因;采用RT-PCR法对CIA组和NCR组进行mRNA水平的检测，采用RT-PCR法和Western blot法检测类风湿关节炎(RA组)和骨关节炎（OA组）滑膜组织中基因mRNA水平和蛋白水平的表达。收集类风湿关节炎血清(RAB组)和正常献血者血清(NCB组)，采用ELISA法检测血清中的表达水平。取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的Si-RNA-PGK1干扰剂特异性抑制PGK1在RAFLS中的表达，阴性Si-RNA为阴性对照组，瞬时转染24 h后，采用RT-PCR法和Western blot法检测抑制效率，采用CCK-8、Transwell、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰PGK1表达后对细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。
　　结果:PCR Array检测显示，CIA组烯醇化酶(ENO1)、己糖激酶2（HK2）、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)较NCR组表达上调（P＜0.05），磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶-1(PCK1)和丙酮酸脱氢酶激酶-4(PDK4)表达下调(P＜0.05);RT-PCR法和Western blot法检测显示，RA组和OA组相比， ENO1和PGK1表达上调（P＜0.05），ELISA法检测结果显示，RAB组和NCB组相比，PGK1表达升高(P＜0.05）。转染特异性Si-RNA-PGK1后，各干扰组与阴性对照组相比，Si-RNA-PGK1干扰剂转染24 h时，PGK1 mRNA水平抑制效果显著（P＜0.05），RAFLS的增殖受到抑制（P＜0.05），细胞的侵袭能力下降(P＜0.05)，IFN-γ和IL-1β分泌降低（P＜0.05）。
　　结论:牛Ⅱ型胶原诱导大鼠和类风湿关节炎滑膜组织中糖代谢关键酶ENO1和PGK1表达增高，类风湿关节炎血液中PGK1表达增加，均提示类风湿关节炎中糖代谢活动增强，导致相关基因的表达异常。这说明糖代谢中的关键酶PGK1参与了细胞异常增殖、迁移以及IFN-γ和IL-1β等炎症因子的分泌表达，说明PKK1对RA炎症因子表达及RAFLS的生物学功能有影响。

目录

声明

摘要

第一章 符号说明

前言

第二章 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

第三章 实验结果

1．3．1 PCR Array筛选类风湿关节炎糖代谢的关键基因

1．3．2 各组EN01、PGK1、HK2、PDK4、PCK1的mRNA和蛋白水平的表达

1．3．3 ELISA法检测RAB组和NCB组EN01、HK2、PDK4和PGK1的表达

1．3．4 免疫组织化学法检测PGK1，EN01、HK2的表达

1．3．5．PGK1 mRNA和蛋白水平表达的实时荧光定量PCR和Western blot检测结果

1．3．6 ELISA法检测TNF-α、IL-1α、IL-1β、IFN-γ等炎症因子在siRNA-PGK1抑制的RASFs中的表达

1．3．7．CCK-8法检测干扰掉PGK1后细胞的增值情况改变

1．3．8 沉默PGK1后对RA-FLS迁移和侵袭的影响

1．3．9 PGK1-siRNA干扰RASFs细胞后对其凋亡的影响

第四章 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文