核糖体蛋白RPS15A促进白血病U937细胞恶性增殖的分子机制研究

摘要

白血病是一类临床常见的血液系统恶性肿瘤，近年来白血病的发病率和致死率呈上升趋势，其预后差，致死率高。据统计，在欧美国家白血病的发病率最高，约为3.2～7.4/10万。在中国，随着环境污染日益严重，白血病的发病率也呈逐年上升的趋势。虽然已有大量研究数据表明多数白血病的发病原因与基因突变有关。目前深入研究白血病发病机制，不断寻找白血病新的作用靶点，开发治疗白血病的特异性药物，已成为临床学者和科学工作者需要面临的重大挑战和任务。
　　近几年，针对白血病的主要的治疗方法是以化疗、放疗及骨髓造血干细胞移植治疗为主，但因化疗的副反应大，而造血干细胞移植费用高昂，患者一般都难以承受。随着分子生物学的不断进步，探索肿瘤的发病机制正逐渐开始成为人们研究的热点。大量的研究表明，多种分子共同参与了白血病的发生发展，这些分子大多在细胞增殖，分化及凋亡中起关键作用。目前，有研究表明发生在核糖体生物合成和蛋白质翻译阶段的异常会影响细胞生长及周期进程，进而会导致肿瘤的发生。许多的研究报道都发现，核糖体蛋白在生物体内表达异常、突变或失调都能为肿瘤的发生发展奠定了一定的基础。
　　核糖体蛋白质(Ribosomal Protein)，也简称为核糖体蛋白(RP)，它是参与构成核糖体的所有蛋白质的统称，RP是构成核糖体的主要成份，在核糖体的翻译过程中发挥重要作用。目前研究发现很多核糖体蛋白在其合成过程中受到转录后水平的调控。而细胞中的磷酸化、泛素化等蛋白酶体降解途径也参与了核糖体蛋白转录后的调控，它可介导蛋白质的生物合成，具有参与DNA修复、细胞发育、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等，在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用。最近研究证实核糖体蛋白参与调控生物细胞的癌变过程。核糖体蛋白通常在恶性肿瘤细胞特异性高表达，从而增强肿瘤细胞增殖，侵袭和迁移的能力。核糖体蛋白作为多数肿瘤的致瘤基因，参与了多种癌症的发生和发展，包括食管癌，胃癌，肺癌等多种恶性肿瘤，是当前靶向癌症治疗研究的热点。RPS15A基因是核糖体蛋白基因家族中的一员。RPS15A基因位于染色体16p13上，具有包含5个外显子的393bp的编码区。RPS15A基因的表达受多个基因调控，在结构上RPS15A基因与原核生物RPS8基因高度同源。最新的一项荟萃分析表明RPS15A在星形细胞瘤、结直肠癌以及前列腺癌中均表达升高。另外，越来越多的研究也证实RPS15A基因参与体内一些如肝癌、骨肉瘤、肺癌等肿瘤的生长过程。但是该基因在白血病中的相关作用尚未有报道。
　　小干扰RNA(siRNA)使目的mRNA发生特异性降解，从而导致目的基因沉默的现象被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。此现象广泛的存在于自然界中，RNAi主要是在转录后水平上调控靶基因的表达，在生物体的进化过程中，当出现病毒感染、重复序列或突变引发的基因组不稳定性时触发的一种保护机制。通过RNA干扰机制可以使正在进化的生物体形成一种能抵御外部侵害的保护机制，这种保护机制在稳定基因组免受外来侵害的过程中也起重要作用。RNA干扰能够在目的细胞中敲除靶基因的表达，因其特异性高、基因敲除彻底等优点而被广泛用于探索基因在人类疾病中的功能，特别是在肿瘤治疗领域。因此本课题运用RNA干扰技术特异性的敲除RPS15A基因的表达，研究其在白血病细胞中的功能表型变化，并进一步探索RPS15A引发白血病可能的分子机制。
　　首先，构建RPS15A基因的敲减及过表达慢病毒载体，包装病毒颗粒并感染人白血病细胞系U937细胞，采用实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)和Western印迹法(Western blot)分别验证RPS15A基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化，确定其干扰效率。其次，采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测RPS15ARNAi慢病毒感染白血病细胞后细胞周期分布情况及凋亡变化，观察并分析RPS15A基因对白血病细胞增殖、细胞周期分布及凋亡的影响。结果表明，沉默RPS15A基因能有效抑制白血病细胞中RPS15A基因在mRNA和蛋白水平的表达;感染干扰慢病毒后，白血病细胞的增殖能力明显受到抑制，说明RPS15A在白血病的发生发展过程中发挥重要作用。流式细胞术的分析表明敲除白血病细胞的RPS15A基因后，细胞周期阻滞于G0/G1期，同时凋亡细胞也显著增加。
　　综上所述，RPS15A基因在体外主要影响白血病细胞的增殖，同时，RPS15A基因可作为新的潜在靶基因，为未来白血病的治疗研究提供新的治疗方法。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一部分 基因RPSl5A RNAi及其过表达慢病毒载体的构建与病毒包装

一、前言

二、材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

三、实验结果

3．1 pLenti-shRPSl5A慢病毒载体质粒的构建和鉴定

3．2 pLenti-oeRPSl5A慢病毒过表达载体质粒的构建和鉴定

3．3 慢病毒包装及滴定测定

四、讨论

五、结论

第二部分 敲减及过表达RPSl5A基因后白血病细胞增殖和凋亡的改变

一、前言

二、材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

三、实验结果

3．1 慢病毒Lenti-shRPSl5A和Lenti-oeRPSl5A感染U937细胞的情况

3．2 qPCR检测慢病毒感染U937细胞后RPSl5A mRNA水平表达

3．3 Western blot检测慢病毒感染U937细胞后RPSl5A蛋白水平表达

3．4 MTT法检测病毒感染U937细胞的增殖情况

3．5 流式分析法检测病毒感染U937细胞后的细胞周期的情况

3．6 流式细胞术检测RNAi慢病毒感染U937细胞后细胞凋亡的情况

四、讨论

五、结论

第三部分 RPSl5A对基因表达谱变化的研究

一、前言

二、材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

三、实验结果

3．1 质检结果

3．2 数据分析

四、讨论

参考文献

综述

致谢

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