共聚焦激光显微内镜在体干细胞归巢示踪及结肠粘膜菌群与生理状态相关性研究

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 共聚焦激光显微内镜在体干细胞归巢示踪研究
　　目的:
　　间充质干细胞是一种具有多能干细胞，具有体内组织修复和免疫调节作用。近年来研究发现，间充质干细胞具有治疗炎症性肠病的重要潜在应用价值。间充质干细胞的移植后在受者体内的转归受到干细胞来源、移植方式、受者免疫状体、移植次数等多方面因素的影响，具有显著的个体差异。然而目前尚没有一种可行的方法个体化地评估输注到体内的间充质干细胞向肠粘膜归巢效率。传统的影像学示踪方法难以有效地区分死细胞残片和存活的间充质干细胞，同时也难以评估干细胞向肠粘膜的归巢效率。共聚焦激光显微内窥镜是近年来发明的一种新型内镜，能够在体内无创、实时地显示组织形态，放大倍率可达1000倍，并具有细胞水平的分辨率。共聚焦激光显微内窥镜所采用的激发波长为488 nm，接波长为505～585 nm，同增强型绿色荧光蛋白的光学特性相匹配。本研究中我们提出使用共聚焦激光显微内镜有可能在活体内以细胞水平的分辨率无创地示踪间充质干细胞向肠粘膜归巢。
　　方法:
　　从Sprague-Dawley大鼠体内分离、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞，分别使用增强型绿色荧光蛋白和活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记骨髓间充质干细胞，使用共聚焦激光显微内镜在体外对标记的间充质干细胞成像。进一步将增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞(eGFP-MSC)通过静脉注射或者腹腔注射途径输注到DSS诱导的结肠炎大鼠模型体内，并使用共聚焦激光显微内镜进行活体成像。所获得的图像同对组织切片进行免疫荧光、免疫组化和荧光免疫原位杂交得到的图像进行对比。明确向结肠粘膜归巢的eGFP-MSC在共聚焦激光显微内镜下的形态特征。进一步比较不同条件下eGFP-MSC向大鼠结肠炎症粘膜的归巢效率，分别以四种不同条件构建移植模型1）大鼠-大鼠干细胞同种异体移植，2）人-大鼠干细胞异种移植，3）低氧处理大鼠间充质干细胞后同种异体移植，4）受体大鼠经白消安免疫抑制处理后移植同种异体干细胞。四种条件下移植后均同法进行共聚焦激光显微内镜成像，示踪间充质干细胞。编写自动化图像识别程序，自动识别图像干细胞并计算频率。
　　结果:
　　通过密度梯度离心法从供体大鼠骨髓中成功分离了骨髓间充质干细胞，所得细胞在适当的条件下能成功分化为骨组织、脂肪组织和软骨组织。间充质干细胞流式细胞鉴定表达CD29(+)，CD44(+)，CD73(+)和CD90(+)，不表达CD34（-），CD45（-）和CD11b/c（-）。上述表型符合大鼠间充质干细胞定义。共聚焦激光显微内镜能够在体外清晰地看到增强型绿色荧光蛋白或活体染料CFSE标记骨髓间充质干细胞，体外成像同荧光显微镜观察特征接近。使用FIVE1共聚焦内镜系统能够在大鼠活体肠粘膜上无创性地观察到eGFP-MSC，其特征为明亮的、圆形并带有内部异质性的细胞核。免疫荧光、免疫组化和荧光免疫原位杂交均证实受体大鼠肠粘膜上存在eGFP阳性的细胞。在大鼠-大鼠同种异体移植、人-大鼠异种移植、低氧诱导间充质干细胞和白消安免疫抑制受体大鼠四种不同条件干细胞移植模型中，活体共聚焦激光显微内镜能够显示移植后向受体大鼠肠粘膜归巢的间充质干细胞数量，并通过自动图像处理程序计数。共聚焦激光显微内镜定量发现，经低氧诱导后，eGFP-MSC向炎症肠粘膜的效率有增加趋势(低氧诱导组114.1 vs其他组合并34.3，t=2.14，P=0.0644)。
　　结论:
　　共聚焦激光显微内镜是一种能够在活体内示踪间充质干细胞移植后向肠粘膜归巢的新型工具，具有良好的应用前景。这种临床可用的无创性的细胞水平示踪技术能够为患者个体化的干细胞治疗提供依据。
　　意义:
　　本研究是世界上首次使用内镜设备对干细胞进行体内示踪，而且具有细胞水平分辨率。对比先前的影像学示踪方法，共聚焦激光显微内镜不会受到死细胞碎片的影响，只有活的完整细胞能够显像，在消化道粘膜对干细胞示踪具有明显的优越性。
　　第二部分 共聚焦激光显微内镜在体评估结肠粘膜生理功能与粘膜菌群相关性研究
　　目的:
　　人类肠道中寄居着数量庞大的微生物群体。近年来，随着高通量测序技术的发展，人类肠道菌群的组成逐渐被人们认识。人类肠道菌群在人类健康的维持中起了至关重要的作用，但在结直肠粘膜上，肠道菌群如何同宿主相互作用仍不清楚。有研究报道，结直肠菌群受到宿主肠道生理状态的影响，例如肠道氧气分压显著影响肠道菌群能量代谢。肠道菌群很可能同时受到多种宿主生理状态的影响，然而先前研究中从未将肠道的多项生理功能同粘膜菌群同时进行分析研究。这可能是受限于临床可行性，同时检测多项指标需要从同一受试者身上取得相应数量的标本，对受试者造成创伤。共聚焦激光显微内镜是近年来进入临床应用的一种新型内镜设备，可以在受试者消化道内进行无创性的成像，在提供实时组织图像的同时，反应结直肠粘膜的多项生理功能。本课题中，我们创新性地提出了共聚焦激光显微内镜能够通过显示宿主肠粘膜的在体生理状态来分析宿主与肠道菌群的相互作用关系。这有助于阐明宿主-肠道菌群相互作用规律。
　　方法:
　　自2013年11月至2014年4月，在山东大学齐鲁医院召集受试者参与此项研究。符合纳入条件的受试者常规进行共聚焦激光显微结肠镜检查。检查过程中先进行白光内镜筛查，对病变部位和临近的正常对照部位使用探头式共聚焦激光显微内镜检查。利用共聚焦激光显微内镜评估受试者结直肠粘膜上皮的生理状态，对结肠粘膜形态和生理功能的9个特征进行评估，分别为杯状细胞密度、隐窝扩大、星状隐窝、长管状隐窝、上皮渗漏荧光素、上皮变厚、隐窝内有荧光素、荧光素漏出血管、浸润的细胞群。对所检查部位的粘膜活检，通过16s rDNA焦磷酸测序的方法检测肠粘膜菌群组成。对测序数据进行初步处理得出每个样本中各物种的含量，通过微生物多样性分析、聚类分析、主坐标分析与非冗余分析和LEfSe分析阐明肠道菌群组成及其同活检部位、疾病状态的关系，利用网络分析分析结直肠粘膜菌群同结直肠粘膜形态和生理状态间的相关关系。利用PICRUSt算法预测菌群的宏基因组，同法利用网络分析分析肠粘膜生理状态同菌群的宏基因组功能通路间的相关性。
　　结果:
　　本研究共筛查267名受试者，其中的39名患者进入最终数据分析。所获得的样本共有结肠腺瘤病变25处，溃疡性结肠炎病变5处，内镜下正常病变39处。粘膜菌群高通量测序的结果经过降噪、去除低质量序列和嵌合体等预处理步骤，共获得554，070条优质序列。不同病变类型间肠粘膜菌群生物多样性无明显不同。腺瘤组的组内距离和不同组的组间距离显著高于正常粘膜的组内距离（两者均p＜0.05）。人类肠粘膜菌群聚集为三个主要的聚类，分别由普氏菌、拟杆菌和乳酸球菌主导。粘膜菌群的聚类同活检部位和疾病状态间并无显著的相关性，但菌群与其栖息的粘膜生理状态间存在密切的关系，后者可以通过共聚焦激光显微内镜无创性地在体观察。网络分析显示结直肠粘膜菌群可以分为两个亚网络与相对孤立的梭杆菌，亚网络内部成员细菌间只存在正相关关系，不同亚网络的成员细菌之间只存在负相关关系。粘膜炎症改变粘膜菌群中两个亚网络的平衡关系。梭杆菌同粘膜生理功能之间存在最密切的关系，而同其他粘膜细菌间没有相关性。炎症细胞浸润同粘膜宏基因组中多个组分存在相关关系，其中包括Ⅳ型分泌系统的VirD2成分。
　　结论:
　　本课题发现肠粘膜菌群同肠粘膜生理状态之间存在密切的相关关系。共聚焦激光显微内镜是一种临床可用的检查工具，可以在体内用来研究肠粘膜生理状态同肠粘膜菌群之间的关联网络。
　　意义:
　　本研究是世界上首次将内镜设备应用于肠道菌群研究，为宿主-菌群关系研究提供了一种全新的、临床可行的研究方法。本研究所发现的粘膜菌群宏基因组同粘膜生理功能之间的相关性为后续机制研究提供了明确的靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分：共聚焦激光显微内镜在体干细胞归巢示踪研究

研究背景

对象与方法

结果

讨论

结论

第二部分：共聚焦激光显微内镜在体评估结肠粘膜生理功能与粘膜菌群相关性研究

研究背景

对象与方法

结果

讨论

结论

研究意义

参考文献

致谢

发表的学术论文目录

外文论文一

外文论文二