育龄期大鼠体内不同雌激素和（或）孕激素水平对围绝经期及绝经后血压的影响

摘要

研究背景
　　原发性高血压（以下简称高血压）是最常见的慢性非传染性疾病，也是心、脑血管疾病的首要危险因素。高血压具有地域分布广、性别差异明显和随年龄增加等流行病学特点。目前研究结果显示:青春期前，男性与女性血压水平无明显差异;育龄期内（青春期后至围绝经期），女性高血压的发病率明显低于同龄男性;而围绝经期及绝经期，女性高血压的患病率明显高于同龄男性。不同生理阶段中高血压病的这种性别差异现象受到高度关注。在女性人群中，高血压的发病率随年龄增长而升高。围绝经期女性高血压的患病率为26.7％，绝经后女性高血压的患病率是围绝经期女性的2倍。校正年龄因素的影响后，绝经后女性患高血压的风险仍明显高于育龄期女性，同时，育龄期卵巢早衰患者中高血压的患病率较同龄健康女性明显升高。提示，女性生殖激素的缺失可能与其高血压的患病风险相关联。
　　女性生殖激素主要包括卵泡刺激素、黄体生成素、雌激素、孕激素、催乳素等。雌激素，以雌二醇(estradiol，E2)为主;孕激素，以孕酮(progesterone，P)为主。E2和P均是一种甾体类固醇激素，对女性生殖周期的形成、第二性征的生长和发育、生殖机能的完善以及多个系统的健康均起着至关重要的作用。育龄期女性在其正常的生理周期内，血压随着生殖激素水平的波动表现出相应改变，这一现象体现出了正常生理周期内激素水平对血压的调节作用。围绝经期伴随的一系列生殖激素的生理性变化影响着众多疾病的发病进程。绝经后女性体内雌激素浓度下降了60％，使得雄激素比例升高，缺乏了“女性优势”，这种变化可能导致了血压的升高。因此，可以推测，育龄期女性较低的高血压发病率可能与体内较高的E2、P水平有关。
　　育龄期较高的E2和P水平与其围绝经期或绝经后血压之间的关联性尚未见报道。因此，育龄期女性自身体内含有天然高E2和（或）P与其绝经后血压和血管内皮功能间的关系值得深入探讨。
　　研究目的
　　本研究以育龄期女性体内的E2和P水平为切入点，通过建立人工大鼠动情周期模型探讨育龄期大鼠体内不同的E2和P水平与其围绝经期及绝经后血压之间的关联性和作用机制。研究结果可为育龄期女性体内E2和（或）P水平与绝经后患高血压风险的关联性评估提供可参考性的理论依据，为绝经后女性高血压的预防与控制工作提供有针对性的建议。
　　研究方法
　　1.实验动物
　　健康雌性Wistar大鼠（10周龄，200±10g）共160只，由山东大学实验动物中心分两批次提供。第一批次100只用于第Ⅰ阶段实验，第二批次60只用于第Ⅱ阶段实验。动物饲养在恒温（22±0.5℃）恒湿(50％～60％)的无特定病原体(no specific pathogens，SPF)动物房内，自由进食饲料和自来水。
　　2.实验设计
　　该实验研究共分两个阶段。第Ⅰ阶段:探讨育龄期不同的17-β E2和P水平对围绝经期及绝经后血压的影响和变化趋势。第Ⅱ阶段:在第Ⅰ阶段的基础上探讨育龄期高17-β E2水平（17-β E2∶P=3∶1/3）或高P水平（P∶17-β E2=3∶1/3）对围绝经期及绝经后血压的影响。
　　第Ⅰ阶段实验用100只大鼠在适应性喂养1周后，随机分为5组:低剂量的雌激素和孕激素组(low dose17-β E2 plus low dose P，LELP)、正常剂量的雌激素和孕激素组（normal dose17-β E2 plus normal dose P，NENP）、高剂量的雌激素和孕激素组（high dose17-β E2 plus high dose P，HEHP）、卵巢切除组、假手术组。第Ⅱ阶段实验用60只大鼠在适应性喂养1周后，随机分为3组:高剂量雌激素组（high dose17-β E2 plus low dose P，HELP）、高剂量孕激素组(high doseP plus low dose17-β E2，HPLE)、卵巢切除组。每组20只。
　　2.建立动物模型
　　第Ⅰ阶段和第Ⅱ阶段实验动物均在卵巢切除后（假手术组除外）经过育龄模拟期、围绝经模拟期和绝经模拟期，以观察育龄模拟期体内不同的17β-E2和（或）P水平对围绝经模拟期和绝经模拟期血压的影响。
　　育龄模拟期:以文献提供的模拟育龄大鼠自然动情周期的激素剂量作为参考剂量，本次实验第Ⅰ阶段和第Ⅱ阶段各组动物17-βE2、P的实验剂量见表2。将17-β E2、P分别溶于花生油，每日16:00-18:00灌胃给药，灌胃体积为0.1 mL/100g。6天为一个动情周期，共持续8个动情周期。卵巢切除组和假手术组给予同等体积的花生油作为对照组。
　　围绝经模拟期:在育龄模拟期实验剂量的基础上，各周期依次递减1/2，共持续5个周期。自第9周始，至第13周末结束。
　　绝经模拟期:在上述围绝经模拟期之后完全停止给予激素的6个连续周期。自第14周始，至第19周末结束。
　　3.动脉观测指标的测量与样本的收集
　　动脉观测指标包括收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolicblood pressure，DBP)、心率(heart rate，HR)。采用BP-1998A-大、小鼠智能无创血压计，在同一个动情周期中的间情期测量尾部动脉血压。测量血压的同时测量动物体质量。
　　分别在卵巢切除前、育龄模拟期末、围绝经模拟期各周期及绝经模拟期末收集样本，每个时间点（除绝经模拟期末）各组均收取2只大鼠血清和腹主动脉样本，-80℃冰箱保存。
　　4.血清激素、ER-β相关蛋白和mRNA表达水平的检测
　　采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清样本中的E2、P浓度和腹主动脉样本中的雌激素受体-β(estrogen receptor-β，ER-β)、血管紧张素Ⅱ-1型受体（angiotensinⅡ type-1 receptor，AT1R）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的蛋白表达水平。
　　采用半定量RT-PCR技术分别检测各腹主动脉样本中ER-β mRNA、VEGFmRNA、AT1R mRNA的表达情况。
　　5.统计分析方法
　　数据采用SPSS19.0软件统计分析。采用重复测量设计资料的方差分析比较各模拟期内组间血压指标及体重的差异。采用Pearson相关性分析用于分析相关蛋白与其mRNA表达水平、血清激素水平、血压水平的相关性。通过单因素方差分析或非参数秩和检验（Kruskal-Wallis H检验）比较各组单个时间点内激素浓度、蛋白及其mRNA表达的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　研究结果
　　1.育龄期不同雌激素和孕激素水平对围绝经期及绝经后血压的影响
　　(1)动脉指标变化
　　育龄模拟期内，组间处理因素明显影响各组的DBP，HEHP明显升高大鼠的SBP和DBP(PSBP=0.027,PDBP=0.005)。
　　围绝经模拟期，组间处理因素明显影响围绝经模拟期内各组的DBP。两两比较结果显示，NENP、HEHP组的DBP明显高于对照组（卵巢切除组）(PNENP=0.047; PHEHP=0.013)。
　　绝经模拟期，组间处理因素及时间与组间处理因素的交互作用影响着绝经模拟期内各组的SBP和DBP。两两比较结果显示，HEHP组明显升高其绝经模拟期内的DBP(P=0.037)。
　　(2)激素水平变化
　　HEHP和NENP组内大鼠血清E2浓度明显升高(P＜0.001)，LELP组内血清E2浓度明显降低（P＜0.05）。HEHP组和NENP组内大鼠血清P浓度在育龄模拟期和围绝经模拟期升高（P＜0.001），HEHP组血清P浓度在绝经模拟期升高(P＜0.001)。
　　2.育龄期高雌激素或高孕激素对围绝经期和绝经后血压的影响
　　(1)动脉指标变化
　　育龄模拟期内，组间处理因素影响该时期内各组的SBP和DBP，HELP组和HPLE组的SBP均明显升高(HELP组:PSBP=0.011，PHR=0.030; HPLE组:PSBP=0.041，PHR=0.061)。
　　围绝经模拟期，组间处理因素影响各组的SBP和DBP。HELP组和HPLE组的SBP均升高，HELP组的DBP升高，HPLE组的脉压差增大（HELP组:PSBP=0.002,PDBP=0.010; HPLE组:PSBP=0.009,PDBP=0.674）。
　　绝经模拟期，组间处理因素影响各组的SBP和DBP。HELP组与HPLE组的SBP均升高，HELP组的DBP明显升高（HELP组:PSBP=0.001，PDBP=0.004;HPLE组:PSBP=0.001,PDBP=0.272）。
　　(2)激素水平变化
　　HELP组血清E2水平和HPLE组血清P水平在各模拟期内均明显升高（P＜0.05）。
　　3.育龄期不同雌激素和（或）孕激素对ER-β等相关蛋白和mRNA表达水平的影响
　　(1)育龄期不同雌激素和孕激素对ER-β、VEGF、AT1R蛋白和mRNA表达水平的影响
　　NENP组和HEHP组内腹主动脉ER-β蛋白及其mRNA的表达水平在育龄模拟期和围绝经模拟期明显升高(P＜0.001)。腹主动脉中ER-β的蛋白表达水平与血清E2、P浓度正相关（rE2=0.670，PE2＜0.001, rP=0.640，PP＜0.001）。ER-β mRNA的表达水平与其蛋白表达水平密切相关(r=0.864，P＜0.001)。
　　NENP组、HEHP组腹主动脉样本中VEGF蛋白及其mRNA的表达水平在育龄模拟期和围绝经模拟期明显升高（P＜0.001）。血清E2和P与腹主动脉中VEGF蛋白的表达水平正相关（rE2=0.824, PE2＜0.001;rP=0.777，PP＜0.001）。VEGFamRNA的表达水平与其蛋白表达水平密切相关(r=0.827，P＜0.001)。
　　HEHP组内腹主动脉AT1R蛋白及其mRNA表达水平在育龄模拟期和围绝经模拟期明显升高（P＜0.01）。血清E2与腹主动脉中AT1R的蛋白表达水平正相关(r=0.209，P=0.046)。AT1R mRNA的表达水平与其蛋白表达水平密切相关(r=0.657，P＜0.001)。
　　(2)育龄期高雌激素或高孕激素对ER-β、VEGF、AT1R蛋白和mRNA表达水平的影响
　　HELP组腹主动脉ER-β蛋白及其mRNA表达水平在育龄模拟期和围绝经模拟期明显升高（P＜0.001）;HPLE组腹主动脉ER-βmRNA表达水平在各模拟期均明显升高（P＜0.01）。ER-β的蛋白表达水平与E2浓度呈正相关(r=0.676，P＜0.001);ER-β mRNA的表达水平与其蛋白表达水平呈正相关（r=0.371，P＜0.001）。
　　HELP组腹主动脉VEGF蛋白及其mRNA表达水平在育龄模拟期和围绝经模拟期明显升高（P＜0.05）。腹主动脉中VEGF的蛋白表达水平与血清E2浓度呈正相关（r=0.624，P＜0.001），与SBP和DBP无明显统计学关联(rSBP=0.132，PSBP=0.189;rDBP=0.030，PDBP=0.767)。VEGFa mRNA的表达水平与其蛋白的表达水平呈正相关(r=0.241，P=0.022)。
　　HELP组腹主动脉AT1R蛋白和mRNA表达水平在各模拟期明显升高（P＜0.05）。AT1R的蛋白表达与E2浓度、SBP呈正相关（r=0.347，P＜0.001;r=0.370，P=0.008），与DBP无明显统计学关联（r=-0.037，P=0.795）。AT1R蛋白的表达水平与其mRNA的表达量水平相关联（r=0.259，P=0.004）。
　　结论
　　1.育龄期大鼠体内生殖激素水平影响其围绝经期及绝经后血压;
　　2.育龄期大鼠体内高水平的E2和P明显升高其围绝经模拟期至绝经模拟期的DBP和HR;育龄期大鼠体内低水平的E2和P对其围绝经模拟期至绝经模拟期的血压无影响;
　　3.育龄期大鼠体内单纯高E2水平升高其围绝经期至绝经后的SBP和DBP;育龄期大鼠体内单纯高P水平升高其围绝经期至绝经后的SBP，促使脉压差增大;
　　4.腹主动脉中VEGF的表达水平与体内血清E2相关，AT1R蛋白的表达水平与血清E2、 SBP相关。体内高水平的E2和（或）P产生的血压升高效应伴随腹主动脉中AT1R蛋白及其mRNA的高表达，同时增加的腹主动脉中VEGF蛋白及其mRNA表达量不能扭转这种血压升高的过程。

目录

声明

摘要

缩写词与符号说明

前言

1．主要试剂与仪器

2．动物模型的建立

3．实验方法

4．统计学分析方法

结果

1．育龄期不同雌激素和孕激素水平对围绝经期及绝经后血压的影响

2．育龄期高雌激素或高孕激素对围绝经期和绝经后血压的影响

3．育龄期不同雌激素和(或)孕激素对ER-β等相关蛋白和mRNA表达的影响

讨论

结论

创新与不足

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文