双叶酸靶向纳米超声造影剂制备及其对乳腺癌细胞寻靶能力初步研究

摘要

第一部分纳米级超声造影剂的制备及其特性研究
　　目的制备新型纳米级脂质超声造影剂(UCAs)，并对其基本特性及显影效果进行研究。
　　方法采用机械振荡法制备脂质UCAs，针对制备过程中3个主要影响因素，设置正交试验，筛选最优制备条件，并在此条件下制备纳米级UCAs，检测其粒径、分散度、Zeta电位、稳定性及体外增强显影效果。
　　结果正交试验结果显示，机械振荡时间对粒径影响有统计学意义（P＜0.05），纳米级UCAs最优制备条件为:DPPA量为0.5 mL，机械振荡时间为90 s，离心时间为3 min;在此条件下制备出的纳米级UCAs平均粒径为（313.20±6.90）nm，分散度为0.15，Zeta电位为-12.40 mV，体外增强显影效果与声诺维相比差异无统计学意义（t=2.02，P＞0.05）。4℃冰箱保存20h后观察，该造影剂基本特性无明显改变。
　　结论本实验制备的纳米级UCAs粒径小，分散均一，性质稳定，具备良好的显影能力，且易于修饰，为进一步载药或构建纳米粒复合体等方面的研究奠定了基础。
　　关键词:超声造影剂;纳米级;脂质;显影;纳米颗粒
　　第二部分双叶酸靶向纳米级超声造影剂对人乳腺癌MCF-7细胞寻靶能力初步研究
　　目的制备一种新型的双叶酸靶向纳米级超声造影剂((FOL)2-NBs)，探讨其在体外与人乳腺癌MCF-7细胞的靶向结合效果，为肿瘤血管外分子成像和治疗奠定基础。
　　方法将L-2-AD作为分枝单元在DSPE-PEG2000-COOH的羧基末端构建树枝状结构。游离羧基DSPE-PEG2000-(COOH)2通过NHS/DCC活化并偶联至FOL-NH2，以产生DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2的缀合物，即每个DSPE-PEG2000连接两个FOL分子，并由1 H NMR证实。将一定量的DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2，DPPC，司盘60和吐温80按固定比例混合，加入到1.5 mL EP管中，1.0 mL PBS定容，通入C3F8气体置换管内空气后密封。将混合物置于60℃的恒温水浴锅中加热至完全溶解，再次用C3F8气体置换管内空气。将EP管在机械振荡器中振荡90 s，用PBS将混合物稀释至5 mL，300 rpm离心5 min，收集底层溶液，即为新型(FOL)2-NBs。采用上述方法制备非靶向纳米级超声造影剂及单叶酸靶向纳米级超声造影剂（FOL-NBs，即每个DSPE-PEG2000链连接一个FOL分子）作为对照。Delsa Nano C纳米激光粒度和Zeta电位分析仪检测粒径、分散度及Zeta电位;采用医用彩色多普勒超声诊断仪检测其体外增强显影效果;采用流式细胞术和荧光显微镜检测三组纳米级超声造影剂对FR过表达的人乳腺癌MCF-7细胞的靶向结合能力。
　　结果1HNMR提示DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2缀合物的成功合成，纯度为90％。在普通光镜下观察纳泡呈圆形，分布均匀且无明显聚集。非靶向、单叶酸靶向及双叶酸靶向组纳米级超声造影剂的平均粒径分别为(129.43±12.33)nm，(244.10±35.09) nm，(286.87±22.96) nm，且后者显著大于前两者（P＜0.01，P＜0.05）。体外显影试验证实，三组在医用彩色多普勒超声诊断仪上均显示出良好的增强显影效果。流式细胞术结果显示，与非靶向组及单叶酸靶向组相比，双叶酸靶向组介导的对MCF-7靶向结合能力显著提高(96.76％vs0.52％，P＜0.001;96.76％vs33.33％，P＜0.001)。荧光显微镜下观察，无靶向NB组中的Hochest染料标记的细胞核呈蓝色荧光，细胞膜周围无其他荧光现象，FOL-NB组中可见Hochest染料标记的细胞核呈蓝色荧光，周围围绕少量DiI染料标记的红色荧光，(FOL)2-NB组也可见呈蓝色荧光的细胞核，周围可见红色荧光团，并且大部分黏附在细胞膜上，相比FOL-NB组荧光强度强。结论通过增加每个DSPE-PEG2000链的叶酸含量，成功地制备了一种新型双叶酸靶向纳米级超声造影剂，较之传统的单叶酸靶向纳米级超声造影剂，其与FR过表达的肿瘤细胞靶向结合能力更强，有望作为FR过表达肿瘤血管外分子成像和治疗的理想造影剂。
　　关键词:纳泡;叶酸受体;超声分子成像;靶向诊疗;肿瘤

目录

声明

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 纳米级超声造影剂的制备及其特性研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分 双叶酸靶向纳米级超声造影剂对人乳腺癌MCF-7寻靶能力初步研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

文献综述 靶向超声造影剂制备及修饰的研究进展

结论与展望

致谢

攻读学位期间发表的学术论文