运用负压外扩张诱导构建预扩张的脂肪组织

摘要

目的：
　　因先天性畸形、外科手术、意外创伤等多种原因导致的软组织缺损是整形外科临床诊疗过程中经常遇到的问题，而寻找到合适的软组织来源用于这种软组织缺损的修复重建一直是整形外科医生面临的巨大难题。
　　已经有越来越多的学者证实，机械牵拉能产生组织再生效应。临床上也已经有多种基于组织机械拉伸的治疗装置。埋置扩张器是临床中广泛应用的技术，其基于组织扩张的原理，对软组织进行机械扩张，被证实能够促进组织细胞的分裂增殖从而增加皮肤软组织面积，在皮肤和软组织的修复缺损以及体表器官的再造中发挥关键作用。近年，通过负压外吸引产生组织外扩张的装置Brava被发明，其基于组织机械拉伸的原理，连续使用一段时间则可以产生稳定的组织生长。Brava诱导产生组织再生的证据给了我们启发，因为通过负压外吸引产生组织外扩张的方式具有无创性，因而更能获得患者的认可，也就意味着具有更大的临床应用价值。
　　本研究拟通过设计大鼠脂肪瓣负压外扩张模型，对带血管蒂的岛状脂肪瓣外部进行负压外扩张，验证脂肪瓣能否在单纯机械力作用下产生组织再生，同时研究脂肪瓣在负压外扩张之后发生的细胞水平和分子水平的变化，初步揭示负压外扩张产生脂肪组织再生的机制，为临床修复软组织缺损提供一个新的选择。
　　方法：
　　本研究分为两个部分：
　　1.运用负压外扩张诱导构建预扩张的脂肪组织的组织学观察
　　构建大鼠带血管蒂脂肪瓣负压外扩张模型，观察经过不同时间的负压外扩张之后脂肪瓣体积的变化，验证负压外扩张是否获得脂肪组织的生长，并通过HE染色、免疫荧光、RT-PCR揭示脂肪瓣在负压外扩张之后组织学的动态变化过程。收集数据后采用相应的统计学方法进行分析处理。
　　2.负压外扩张诱导脂肪组织再生的机制的初步研究
　　利用大鼠脂肪瓣负压外扩张模型，观察负压外扩张之后脂肪组织中炎症细胞因子表达情况，探讨负压外扩张所产生的炎症微环境对于脂肪组织再生所发挥的诱导和调节作用。收集数据后采用相应的统计学方法进行分析处理。
　　结果：
　　1.对照组脂肪瓣体积增长不明显；实验组体积随时间增加而增长明显。脂肪瓣体积由基线的1.633±0.163ml在第4周增加为1.783±0.147ml（对照组）和2.15±0.350ml（实验组）；第8周增加为1.850±0.164ml（对照组）和2.917±0.365ml（实验组）；第12周增加为1.867±0.150ml（对照组）和3.717±0.337ml（实验组）。其中实验组脂肪瓣在第4周（P<0.05）、8周（P<0.001）和12周（P<0.001）均大于对照组。实验组脂肪瓣在16周降低为3.317±0.256ml，较12周实验组有部分回缩（P<0.05），但仍然是基线体积的约两倍。
　　经过负压外吸引后脂肪组织中血管化丰富的纤维结缔成分增多。血管计数结果显示实验组毛细血管密度在第4、8、12周均表现出显著高于对照组，在第16周相较于12周有明显的回落，呈现为接近基线脂肪瓣的水平。
　　脂肪组织中ki67+/CD34+细胞在实验组中显著增加，在1周时达到峰值，然后从4周到12周呈现逐渐下降。统计学分析显示在第1、4、8、12周，实验组的ki67+/CD34+细胞数多于对照组，在16周则降为接近对照组。该结果提示负压外扩张之后发生了活跃的血管重构和细胞增殖。
　　脂肪组织经过负压外吸引1周后，PPARγ和CEBPβ的相对表达量即有显著升高；随着处理的时间增加，其相对表达量进一步增加；在停止负压外吸引后，PPARγ和CEBPβ的相对表达量回落到低水平。该研究结果提示负压外扩张处理能够上调成脂分化过程。
　　2.实验组在经过负压外吸引后，IL-1β，IL-6，TNF-α，MIF水平显著升高，在1周时达到峰值，其中IL-1β、IL-6分别升高约3、6倍，TNF-α升高约13倍，MIF升高约14倍。在4、8、12周各因子水平均有回落，但仍然维持高表达水平，对比第1周时降低差异显著。停止负压外吸引后各因子水平继续回落至对照组水平。结合第一章的结果，提示负压外扩张产生的炎症反应状态可能参与了脂肪组织再生的调控。
　　结论：
　　1．通过负压外扩张成功诱导构建了预扩张的脂肪组织（Expandedprefabricatedadiposetissue，EPAT），其是脂肪组织再生的结果。并且该过程伴随着动态的组织学变化，负压外扩张早期诱导了脂肪组织中血管再生和细胞增殖，在后期诱导形成了成脂分化微环境。
　　2.负压外扩张诱导的脂肪组织再生是多种复杂机制共同参与的结果，炎症可能通过炎症细胞因子以及炎症细胞的参与调控了脂肪组织的再生过程。

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中英缩略词表

第1章 运用负压外扩张诱导构建预扩张的脂肪组织的组织学观察

1.1 引言

1.2 材料

1.2.1 实验动物

1.2.2 主要试剂

1.2.3 主要仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 动物模型构建

1.3.2 实验分组

1.3.3 组织取材

1.3.4 脂肪瓣组织切片HE染色

1.3.5 脂肪瓣组织切片免疫荧光分析

1.3.6 脂肪瓣组织real-time PCR（RT-PCR）检测

1.3.7 统计方法

1.4 结果

1.4.1 大体数据采集

1.4.2 脂肪瓣组织学观察

1.4.3 脂肪组织中血管密度分析

1.4.4 脂肪组织中细胞增殖情况

1.4.5 脂肪组织中成脂基因表达

1.5 讨论

1.6 结论

参考文献

第2章 负压外扩张诱导脂肪组织再生机制的初步研究

2.1 引言

2.2 材料

2.2.1 实验动物

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器与设备

2.3 方法

2.3.1 脂肪瓣负压外扩张模型建立后组织取材过程

2.3.2 组织标本炎症水平检测

2.3.3 统计方法

2.4 结果

2.4.1 脂肪组织中炎症水平

2.5 讨论

2.6 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

综述:负压外扩张辅助自体脂肪移植：基于Brava的系统性综述