胎鼠胰腺干细胞体内移植治疗1型糖尿病的实验研究

摘要

临床胰岛移植最近几年的突破性进展，为糖尿病的治愈带来了希望，但是供体缺乏制约了该项技术的广泛应用。干细胞具有高度分化和自我更新的的能力，是解决胰岛细胞来源的热点途径之一。本研究采用干细胞体内移植的方法，观察干细胞在体内分化的效果，为糖尿病的治疗提供一种新的思路。 第一部分不同移植部位对胎鼠胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团的影响 目的：利用胎鼠胰腺干细胞移植入1 型糖尿病模型大鼠，探讨胎鼠胰腺干细胞在不同移植部位体内分化为胰岛细胞团的可能性，为1型糖尿病的治疗寻找一种新的可行的方法。 方法：分离纯化孕16日SD 大鼠胎鼠胰腺干细胞培养传代；荧光原位杂交（FISH）检测Y 染色体；取第3代雄性胎鼠胰腺干细胞行Nestin、PDX-1 免疫组化及流式细胞术鉴定。每只雌性糖尿病模型移植雄性胎鼠1×106个胰腺干细胞，分为胰腺原位移植组（10 只）、肝内移植组（10只）、肾包膜下移植组（10 只）、实验对照组（10 只）及空白对照组（10 只），定期监测各组大鼠血糖及血浆胰岛素含量，8周后处死大鼠，取相应组织观察胎鼠胰腺干细胞体内转分化情况并行FISH 检测Y染色体鉴定。 结果：12 只胎鼠中有5 只经FISH 检测为雄性。雄性胎鼠胰腺干细胞培养传代3代后细胞爬片免疫组化示存在Nestin 阳性细胞，流式细胞术测定nestin 阳性细胞含量占74.1％。胰腺实质内移植组在第3周血糖开始下降，血浆胰岛素水平逐渐升高；第5周血糖降至正常水平并维持，血浆胰岛素达到正常水平。病理学观察在胰腺内可见外源性胰岛样细胞团，胰岛素免疫组化阳性，Nestin 免疫组化强阳性，FISH检测Y 染色体阳性。而肝内移植组及肾包膜下移植组各大鼠仍维持高血糖状态，相应组织均未见外源性细胞团形成。 结论：分离纯化的胎鼠胰腺干细胞在胰腺内原位移植后在体内可转分化为胰岛样细胞团，并使血糖降至正常，胎鼠胰腺干细胞原位移植可能成为1 型糖尿病治疗的一种新的可行方法。 第二部分胎鼠胰腺干细胞原位移植治疗 1 型糖尿病的实验研究 目的：原位移植胎鼠胰腺干细胞，探讨不同数量级的胎胰干细胞在糖尿病鼠胰腺微环境中转分化为胰岛样细胞团、治疗1 型糖尿病的可行性。 方法：分离纯化孕16日SD 大鼠胎鼠胰腺干细胞培养传代；荧光原位杂交（FISH）检测Y 染色体鉴定雄雌；取第3代雄性胎鼠胰腺细胞行Nestin、PDX-1 免疫组化及流式细胞术鉴定；取第5代雄性胎鼠胰腺干细胞，分为三个数量级，分别为1×105个/只（A组，10 只）、1×106个/只（B组，10 只）、1×107个/只（C组，10 只）各组行糖尿病大鼠胰腺内原位移植，PBS 溶液胰腺实质内注射作为实验对照组（D组，10 只），正常大鼠作为空白对照组（E组，10 只）。定期监测各组大鼠血糖情况及留取血浆ELISA 测胰岛素含量，8周后取大鼠胰腺组织切片观察，FISH 检测Y 染色体，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）观察各组大鼠胰腺内nestin、PDX-1 及胰岛素等mRNA的表达情况，Western blot检测PDX-1 及胰岛素的蛋白表达水平。 结果：12 只胎鼠中有5 只经FISH 检测为雄性。雄性胎鼠胰腺干细胞培养传代3代后细胞爬片免疫组化示存在Nestin和PDX-1 阳性细胞，流式细胞术测定nestin 阳性细胞含量占74.1％。A组大鼠于第3周开始血糖逐渐下降，血浆胰岛素水平逐渐升高但均未能达到正常水平，B组及C组大鼠于移植后第3周血糖开始下降，血浆胰岛素水平逐渐升高；第5周血糖降至正常水平并维持，血浆胰岛素达到正常水平。取第8周大鼠胰腺组织切片HE 染色A、B、C组均可见外源性细胞团，FISH 检测Y 染色体阳性。RT-PCR 检测示B组其内胰岛素的mRNA 表达明显高于D组（P<0.05），与正常大鼠比较无显著性差别（P>0.05），而nestin 及PDX-1的mRNA 表达量高于D组及E组（P<0.05）。Western blot 示B组胰腺组织内胰岛素含量接近正常大鼠（P>0.05），而PDX-1的含量高于正常大鼠(P<0.05)。 结论：糖尿病大鼠每只予1×106个胎鼠胰腺干细胞进行原位移植后可在体内转分化为胰岛样细胞团且具有良好的功能，移植后可使血糖降至正常，胎鼠胰腺干细胞原位移植可能为1型糖尿病的治疗提供了一个新的可行方法。