TSP2-8CUB1+2片段影响流动状态下ADAMTS-13活性的实验研究

摘要

目的：探讨在流动状态下TSP2-8CUB1+2 片段是否影响ADAMTS13 裂解活性。
　　 方法：
　　 ⑴以人ADAMTS-13 cDNA 为模板，通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13 cDNA；并重组于真核表达载体pcDNA3.1-V5-His，构建重组质粒。
　　 ⑵以脂质体法将全长和重组的质粒转染COS7细胞，用Western blot法对目的蛋白质的表达进行鉴定。
　　 ⑶用Western blot 方法检测对比分析流动状态下全长和重组蛋白的活性差异。
　　 结果：
　　 ⑴琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR 扩增出的特异片段约2163bp，DNA 测序结果与Genebank 报道的完全一致，成功构建了重组质粒ADAMTS-13(缺失TSP2-8 CUB1+2)-pcDNA3.1/V5-His-TOPO。
　　 ⑵收集稳定转染后的COS7细胞培养液，经超滤管浓缩后，进行Western blot电泳分析，结果证实全长和重组蛋白为细胞上清分泌性表达。
　　 ⑶在mini vortexer 诱导的剪切力条件下，缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS13蛋白活性较全长ADAMTS13蛋白活性显著下降。
　　 结论：
　　 ⑴成功构建了缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13重组质粒，并表达了全长和重组的ADAMTS13蛋白。
　　 ⑵初步证实：在流动状态下，ADAMTS13 羧基端TSP2-8CUB1+2是裂解vWF的重要的区域。